MicroRNA Expressionsprofile der Menschen iPS-Zellen, Retinapigmentepithel Abgeleitet aus iPS und Fetal Retinapigmentepithel
Summary
Die microRNA (miRNA)-Profile der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen), retinale Pigmentepithel (RPE) aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) (iPS-RPE) und fetale RPE abgeleitet, wurden verglichen.
Abstract
Ziel des Berichts ist es, die Protokolle für den Vergleich der microRNA (miRNA)-Profile von Menschen verursachten-pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen), retinale Pigmentepithel (RPE) aus menschlichen iPS-Zellen (iPS-RPE) abgeleitet und fetale RPE zu beschreiben. Die Protokolle beinhalten Sammlung von RNA für Microarray-Analyse durch, und die Analyse von Microarray-Daten zu miRNAs, die unterschiedlich zwischen drei Zelltypen exprimiert werden. Die Methoden zur Kultur der iPS-Zellen und fetaler RPE erklärt. Das zur Unterscheidung von menschlichen RPE von iPS-Protokoll verwendet, ist ebenfalls beschrieben. Die RNA-Extraktion Technik, die wir beschreiben, wurde ausgewählt, um maximale Erholung von sehr kleinen RNA, die für die Verwendung in einem miRNA-Microarray zu ermöglichen. Schließlich wird zellulären Weg-und Netzwerk-Analyse von Microarray-Daten erläutert. Diese Techniken werden den Vergleich der miRNA-Profile von drei unterschiedlichen Zelltypen zu erleichtern.
Introduction
Stammzellen haben die Fähigkeit, ohne Begrenzung der Möglichkeit, in jedem Zelltyp zu differenzieren replizieren. Die Entwicklung von Techniken, um Körperzellen in pluripotente Stammzellen umzuprogrammieren hat große Aufregung in der Forschung und bei den Ärzten hervorgerufen, wie die Einführung von personalisierten Geweberegeneration ist am Horizont ein. Induzierte pluripotente Stammzellen-(iPS-Zellen) weisen die gleichen Merkmale der unbegrenzten Replikationspotential und Pluripotenz embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) unter Umgehung der ethischen Dilemmata mit WSR verbunden. Darüber hinaus wird von einem Patienten abgeleitete Stammzellen nicht stimulieren eine Immunantwort, die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen therapeutischen Anwendungen 2-3 stark erhöht. Unter bestimmten Kulturbedingungen haben iPS-Zellen gezeigt worden, um in verschiedene Zelltypen in vitro, einschließlich Herzmuskelzellen, Neuronen pankreatischen Betazellen, Leberzellen und Retina-Pigmentepithel (RP unterscheidenE) 12.04.
Das RPE ist eine spezialisierte Schicht pigmentierten Epithelzellen an der Rückseite der Retina, die mehrere Funktionen, die für visuelle Gesundheit und Funktion wie die Absorption von Streulicht, Phagozytose der Photorezeptoraußensegmente führt befindet, und die Verarbeitung von Retinoiden für die Herstellung der visuellen Chromophor. Dysfunktion des RPE aufgrund von Schäden oder Krankheit zutiefst betroffen Photorezeptor Gesundheit und visuellen Funktion, wie durch die blendende Krankheiten, die das Ergebnis der zugrunde liegenden RPE Pathologie wie der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), Stargardt-Krankheit und Retinitis pigmentosa (RP) sind belegt 13. Wirklich wirksame Behandlungen, die Vision wiederherstellen können nicht erreicht wurden, und der Ersatz der erkrankten RPE mit gesunden RPE kann die beste Option, um einen Verlust der Sehkraft 14-15 zu verhindern. RPE von iPS (iPS-RPE) abgeleitet ist eine mögliche Quelle von Zellen, die beschädigte RPE ersetzen. iPS-RPE drückt Merktic RPE Proteine LRAT, CRALBP, PEDF und RPE65; zeigt die klassische stark pigmentierten hexagonalen RPE-Morphologie; und führt RPE-Funktionen wie Phagozytose, Retinoid-Verarbeitung und Sekretion von 11 – cis-Retinal 5,16. Doch bevor iPS-RPE therapeutisch genutzt werden kann, die iPS-RPE gründlich charakterisiert werden. Verständnis der Faktoren, Differenzierungs RPE regeln ist notwendig, um die Ausbeute und Reinheit der Zellen für klinische Anwendungen verwendet werden, zu verbessern.
Zelldifferenzierung ist das Ergebnis stark regulierten Genexpression. Epigenetische Umbau des Genoms und die Koordination von Transkriptionsfaktoren sind für Zellschicksal Entscheidungen, die während der Differenzierung und Entwicklung 17 auftreten erforderlich. Verordnung der Nachricht RNA (mRNA) Übersetzung von microRNA (miRNA) präsentiert noch eine weitere Ebene der Regulierung, die das Schicksal der Zelle 1 betrifft. MiRNAs sind kurze, ~ 22 nt, Längen von Nukleotiden, die entweder unterdrücken ÜbersetzungBindung an die 3'-UTR der mRNA oder mRNA, die für das Ziel-Abbau. MiRNAs haben in nahezu allen Geweben nachgewiesen worden, und bis heute über 2.000 einzigartigen menschlichen microRNAs im miRBase Datenbank registriert. Da miRNAs erfordern nur eine teilweise Komplementarität zu der Ziel-mRNA binden kann eine einzelne miRNA potenziell Dutzende oder Hunderte von Targets und umgekehrt zu binden, dh eine einzelne mRNA kann durch verschiedene miRNAs richtet sein. Diese Promiscuous Bindung charakteristisch erhöht drastisch die Komplexität der Regulierung sowie der Schwierigkeitsgrad der Bestimmung der Funktionen einzelner miRNAs und die jeweiligen Aufgaben in der zellulären Funktionen 18-21. Dennoch haben Studien gezeigt, dass miRNA verfeinert Genexpression während der Differenzierung durch die Beeinflussung DNA-Methylierungsstatus 17. In einer Studie mit mehr spezifisch auf die RPE, miR-204/211 wurde gezeigt, dass die epithelialen Phänotyp der RPE 22 zu fördern. Eine weitere Gruppe untersuchte die miRNA-Profilvon RPE während der Differenzierung von ES-Zellen und zeigte verschiedene Sätze von miRNA werden während des Differenzierungsprozesses 23 ausgedrückt. In der Tat kann miRNA Profile eindeutig unterscheiden Zelltypen, einschließlich ES Zellen, Vorläuferzellen und terminal differenzierte Zellen 24,25. Über 250 miRNAs in der Netzhaut exprimiert. Basierend auf diesen Studien die Hypothese auf, dass wir miRNAs eine wichtige Rolle während der Differenzierung von RPE von iPS.
Ziel des Berichts ist es, die Protokolle für die Differenzierung der RPE von IMR90-4 iPS-Zellen zu beschreiben, Sammlung von RNA für die Analyse von Mikroarrays und die Analyse von Microarray-Daten zu miRNAs, die unterschiedlich zwischen drei Zelltypen exprimiert werden, iPS-Zellen zu identifizieren , iPS-RPE und fetale RPE. Gesamt-RNA wurde aus Kulturen von jedem Zelltyp extrahiert und hybridisiert mit einem Mikroarray-miRNA, die bestimmte für 1.205 menschlichen miRNAs und 144 viralen miRNAs Sonden. Die Microarray-Ergebnisse wurden vergleichend zu bestimmen, welche miRNAs differentiell zwischen den verschiedenen Zelltypen exprimiert. miRNAs mit 2-fach oder mehr-fache Veränderung der Expression wurden für die weitere Analyse ausgewählt. Eine miRNA-Analyse-Software-Programm wurde verwendet, um potentielle Ziele der differentiell exprimierten miRNAs identifizieren und Mobilfunknetze durch die ausgewählten miRNAs reguliert erzeugen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im Ergebnis dieser Bericht beschreibt die Kultur zu iPS-Zellen verwendeten Methoden, iPS-RPE und fetale RPE. RPE von iPS abgeleitet sind morphologisch und funktionell ähnlich fetale RPE. Die iPS-RPE drückt auch RPE charakteristischen Genen einschließlich RPE65, CRALBP, PEDF und LRAT 16. Zur weiteren Charakterisierung dieser Zellen wurde RNA extrahiert und dazu verwendet, Mikroarray-Analyse durchzuführen, um differentiell exprimierte miRNA identifizieren. Die Analyse der Signalintensitäten ergab, dass die…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die hierin enthaltenen Meinungen und Aussagen sind die privaten Ansichten der Autoren und sind nicht als offizielle oder als die die Ansichten der Abteilung der Armee oder des Verteidigungsministeriums ausgelegt werden.
Diese Untersuchung wurde durchgeführt, während die Autoren Whitney A. Greene, Alberto Muñiz und Ramesh R. Kaini hielt eine Postdoctoral Research Associateship National Research Council an der USAISR.
Microarray-Assays wurden durch die Greehey Kinderkrebsforschungsinstitut Microarray-Core Facility und Bioinformatik-Abteilung an der UT Health Science Center in San Antonio durchgeführt.
Diese Arbeit wurde von der US Army Klinische Rehabilitative Medizin Research Program (CRMRP) und Operational Military Medicine Research Program (MOMRP) unterstützt.
Materials
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
| Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |
References
- Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
- Romano, G., et al. A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening. J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).
- Almeida, P. E., et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives. Circ Res. 112, 549-561 (2013).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).
- Kokkinaki, M., et al. Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells. 29, 825-835 (2011).
- Bharti, K., et al. The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Pera, M. F. Stem cells. A new year and a new era. Nature. 451, 135-136 (2008).
- Subba Rao, M., et al. Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).
- Lee, K. S., et al. Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Alipio, Z., et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).
- la Cour, M., Tezel, T. The retinal pigment epithelium. Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (2009).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).
- Leonardo, T. R., et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).
- Arora, A., et al. Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development. BMC Dev Biol. 10, (2010).
- Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).
- Mallanna, S. K., Rizzino, A. Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol. 344, 16-25 (2010).
- Guo, H., et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466, 835-840 (2010).
- Adijanto, J., et al. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression. J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).
- Hu, G., et al. Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells. PLoS One. 7, (2012).
- Wilson, K. D., et al. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).
- Neveu, P., et al. MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states. Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
- Qiagen, miRNeasy Mini Handbook. Sample and Assay Technologies. , (2013).
- . Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit. Agilent Technologies. , (2011).
- . Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. , (2010).
- . The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. About Biotechnology. , (2013).
