Recuperación Quirúrgica, aislamiento y<em> In vitro</em> Ampliación del cruzado anterior humana derivados de las células del ligamento para aplicaciones de ingeniería de tejidos

Summary

Para aplicaciones futuras como un parche para reparar desgarros parciales del ligamento cruzado anterior (ACL), las células derivadas de ACL humana fueron aisladas de tejido obtenido durante los procedimientos reconstructivos, expandidas in vitro y cultivados en los andamios de ingeniería tisular. A continuación, se realizó la adhesión celular y la morfología para confirmar la biocompatibilidad de la superficie del andamio.

Abstract

La lesión del ligamento cruzado anterior es un problema comúnmente encontrado en los individuos activos. Incluso los desgarros parciales de este intra-articular del ligamento de la rodilla conducir a deficiencias biomecánicas que la función y la estabilidad deterioran. Las opciones actuales para el tratamiento de los desgarros del LCA parciales van desde no quirúrgico, el tratamiento conservador con múltiples opciones quirúrgicas, tales como: la modificación térmica, la reparación de un solo paquete, la reconstrucción completa, y la reconstrucción de la parte dañada del ligamento nativo. Pocos estudios, si los hay, han demostrado un método único para la gestión de ser siempre superior, y en muchos casos los pacientes seguir demostrando la inestabilidad persistente y otras comorbilidades.

El objetivo de este estudio es identificar una fuente de células para la utilización potencial en el desarrollo de un parche de ingeniería tisular que podría implementarse en la reparación de un LCA desgarrado parcialmente. Un nuevo protocolo fue desarrollado para la expansión de las células derivadas de patients sometidos a la reconstrucción del LCA. Para aislar las células, tejido HACL picada obtenida durante la reconstrucción del ACL se digirió en una solución de colagenasa. La expansión se realizó usando medio DMEM/F12 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (P / S). Las células entonces se almacenaron a -80 º C o en nitrógeno líquido en un medio de congelación que consiste de DMSO, de FBS y el medio de expansión. Después de la descongelación, las células HACL derivados fueron luego sembradas en un andamio de ingeniería tisular, de PLAGA (ácido láctico-co-glicólico Poli) y el control de cultivo de tejidos de poliestireno (TCPS). Después de 7 días, SEM se realizó para comparar la adhesión celular a la PLAGA contra el TCPS de control. La morfología celular se evaluó mediante tinción de inmunofluorescencia. SEM (microscopio electrónico de barrido) micrografías demostraron que las células crecieron y se adhirieron sobre ambas superficies de PLAGA y TCPS y fueron confluentes sobre las superficies enteras por día 7. La tinción de inmunofluorescencia mostró morfológica normal, no estresadoAL patrones en ambas superficies. Esta técnica es prometedor para aplicaciones en la regeneración y la reconstrucción de ACL.

Introduction

El ligamento cruzado anterior (LCA) es un ligamento intraarticular comúnmente lesionado de la rodilla. Aproximadamente 200.000 (LCA) se reportan anualmente en los Estados Unidos. Más del 75% de los pacientes que sufren una lesión del LCA opt para la cirugía reconstructiva ortopédica ^1,2,3,4. La intervención quirúrgica está indicada a menudo debido a un inherentemente pobre potencial curativo ^3. La reconstrucción del ACL se realiza típicamente por medio de un autoinjerto o aloinjerto de tendón. Autoinjerto y aloinjerto representan el estándar de oro para la reconstrucción, ya que cuentan con altas tasas de éxito, y la reparación con sutura primaria, la otra opción de tratamiento, ha mostrado tasas de fracaso de hasta el 94% ^5,6,7.

Desgarros parciales del ligamento cruzado anterior representan el 10% y el 28% de todas las rupturas del LCA ^8. En un estudio prospectivo, Noyes et al. Estima que el 50% de los pacientes con desgarros parciales que afectan a más de la mitad de la ACL ACL progresó hasta completar insuficiencia después notratamiento quirúrgico ^9. Otros estudios reportan persistente inestabilidad y disminución de la función con menos de 30% de los pacientes capaces de volver a su pre-lesión ^{9,10,11,12,13} nivel de actividad. Las opciones de tratamiento son limitadas e incluyen modalidades conservadoras, la contracción térmica de permanecer ACL, o la reconstrucción del LCA. Recientemente, ha habido un creciente interés en la reparación primaria aumentada. Estas técnicas utilizan productos biológicos para mejorar la reparación de sutura primarios ^14. La investigación reciente ha intentado cosechar-mesenquimales como HACL deriva células madre para eludir limitaciones de injerto, ^31,32 pero la validez y la eficacia de estas células es todavía desconocido. La fuente de células ideal para aplicaciones de ingeniería de tejidos parece ser no mesechymal HACL deriva células de fibroblastos.

La investigación actual se centra en la identificación de un material de matriz adecuado y fuente de células para el andamiaje de ingeniería. Es un procedimiento estándar para una rotura de ligamentos que ser descartado como doresiduos rgical durante la cirugía de reconstrucción, sin embargo, este ligamento dañado puede ser una fuente de calidad para la adquisición de células necesarias para desarrollar y mejorar un tejido ideal de ingeniería reemplazo ACL. Nuestro laboratorio ha desarrollado un protocolo para la expansión in vitro de estas células derivadas HACL cosechados. El uso de una matriz 2D diseñado infundido con células HACL derivados, hemos diseñado un parche que podrían aumentar la reparación del LCA parcial y fortalecer los ligamentos desgarrados.

Protocol

1. Recuperación Quirúrgica Nota: La aprobación IRB se obtuvo para recoger el muñón ACL durante la cirugía de reconstrucción del LCA. Exención IRB fue dado como el muñón ACL utilizados han sido generalmente descartada como desecho quirúrgico. 20 pacientes se utilizaron para recoger el muñón ACL. Administrar anestesia general y antibióticos preoperatorios según el protocolo de la institución para el paciente. Aplicar el torniquete e inflar 100 mg por encima…

Representative Results

El modelo de trabajo para la recuperación quirúrgica, la digestión del tejido y aislamiento de la humana ligamento cruzado anterior (HACL) células derivadas se muestra en la Figura 1. Las células que migraron a partir de los explantes y se adhirieron a los matraces T-25. Estas células se cultivaron durante 3 días y luego se visualizaron bajo un microscopio de luz (Figura 2). Una monocapa confluente se obtuvo por día 7. La presencia de células sanas, viables indica la recuperaci…

Discussion

El objetivo principal de este estudio andamio hACL/2D era utilizar las células obtenidas en un parche para aumentar la reparación primaria del LCA se desgarra parciales. El tratamiento no quirúrgico de las rupturas del LCA parciales puede incluir un breve período de inmovilización, refuerzos, un programa de rehabilitación progresiva, y las evaluaciones de seguimiento regulares ^13,16,17. Sin embargo, muchos estudios demuestran que el tratamiento conservador en los atletas se ha asociado con malos resulta…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Petri-dish	Fisher Scientific	08-757-103C
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994
Collagenase	Gibco	17018-029	Store at 40C
DMEM/F-12	Cellgro	10-092-CV	Store at 40C. Warm in 370C water bath before use.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10082	Store at -800C
Penicillin/Streptomycin	Lonza	17-602E	Store at 40C
Centrifuge Tubes- 15 ml	Corning	430790
T-25 flasks	BD Falcon	3013
Trypsin-Versene mixture	Lonza	17-161E	Store at 40C. Warm in 370C water bath before use.
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100	Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation.
Cryogenic vials	Corning	430489
PLAGA	Purac Biomaterials	Purasorb PLG8523	Store at -800C
TCPS disks	Fisher Scientific	12-545-82
Dichloromethane	Fisher Scientific	AC36423-0010	Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place.
Bytac paper	Saint gobin performance plastics	1420652
Scintillation vial	Fisher Scientific	03-339-21G
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906	Store at 40C
Tween	Fisher Scientific	BP337-500
mouse Anti-β-actin antibody (10 Ab)	Sigma Aldrich	A5441	Store at -200C
goat-anti-mouse antibody (20 Ab)	Cell Signaling	4408	Store at -200C
Hoechst dye	Sigma Aldrich	14530	Store at -200C
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glutaraldehyde	Fisher Scientific	BP2547-1	Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes.
Hexamethyldisilazane	Fisher Scientific	AC43085-1000	Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes.
Sterile Scissors	McKesson	25-716
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Light Microscope	Olympus	CK40
Water Bath	Thermo scientific	2845
Vortex	Labnet	VX-200
Glass Petri plates	fisher Scientific	S31473
Acu-Punch	Acuderm Inc.	P1225	Acu-Punch was used to cut 12mm disks
Cacodylate buffer	Sigma Aldrich	97068	Flammable liquid, carcinogen and irritant.
Osmium tetraoxide	Sigma Aldrich	201030	Highly toxic
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	Harmful if swallowed
Ethanol	Decon Labs	2705	Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition.
General/regional Anesthesia	Amphastar pharmaceuticals		1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance
Antibiotics	Hospira	0409-0805-01	Ancef 1g i.v.
Arthroscopy trocar	Smith and Nephew
Arthroscopy Camera	Smith and Nephew
Arthroscopic grasper and bitter	Arthrex
4.5mm shaver	Arthrex
Interference Screws	Arthrex		stainless steel screws
Sputter Coater	Polaron	E5400