Un metodo di Permeabilization di<em> Drosophila</em> Gli embrioni per saggi di piccole molecole di attività
Summary
Introduzione di piccole molecole, allo sviluppo di Drosophila embrione offre un grande potenziale per la caratterizzazione dell'attività biologica di nuovi composti, farmaci e tossine, nonché per sondare percorsi di sviluppo fondamentali. I metodi qui descritti delineano misure che superano le barriere naturali di questo approccio, ampliando l'utilità del modello di embrione di Drosophila.
Abstract
L'embrione di Drosophila è stato a lungo un potente modello di laboratorio per chiarire i meccanismi molecolari e genetici che controllano lo sviluppo. La facilità di manipolazioni genetiche con questo modello ha soppiantato approcci farmacologici che sono comuni in altri modelli animali e saggi cellulari. Qui descriviamo i recenti progressi in un protocollo che consente l'applicazione di piccole molecole per la mosca della frutta in via di sviluppo dell'embrione. Il metodo dettagli passi per superare l'impermeabilità del guscio, pur mantenendo la vitalità dell'embrione. Guscio d'uovo permeabilizzazione attraverso una vasta gamma di stadi di sviluppo si ottiene con l'applicazione di una precedentemente descritto d-limonene embrione permeabilizzazione solvente (EPS 1) e gli embrioni di invecchiamento a temperatura ridotta (18 ° C) prima di trattamenti. Inoltre, l'uso di un colorante rosso lontano (CY5) come indicatore di permeabilizzazione è descritto, che è compatibile con le diverse applicazioni che coinvolgono influenza rosso e verde di seriecoloranti orescent in preparazioni dal vivo e fissi. Questo protocollo è applicabile a studi utilizzando composti bioattivi per sondare meccanismi di sviluppo e per gli studi volti a valutare l'attività teratogena o farmacologica di uncharacterized piccole molecole.
Introduction
L'embrione Drosophila continua ad essere un modello di primo ministro per studio dei meccanismi fondamentali dello sviluppo 2. Questo potente modello è supportato da una vasta gamma di strumenti genetici molecolari che permettono manipolazioni essenzialmente qualsiasi gene in qualsiasi punto nel tempo e all'interno di qualsiasi organo in via di sviluppo. Le dimensioni ridotte, rapido sviluppo, e ampia caratterizzazione della morfogenesi di Drosophila ne fanno un modello di scelta per schermi genetici, molti dei quali hanno scoperto percorsi di sviluppo fondamentali 3,4. Numerosi fenotipi in Drosophila sono stati caratterizzati e sono facilmente interpretabili, spesso fornendo un mezzo per identificare meccanismi genetici molecolari sottostanti responsabili di un tratto anormale.
Storicamente, una lacuna del modello embrione fly è stata la difficoltà di introdurre piccole molecole ai tessuti embrionali. Questo ostacolo ha posto limitazioni: 1) ciing conosciuti piccole molecole bioattive come sonde per interrogare meccanismi di sviluppo e 2) con questo modello istituito per valutare l'attività teratogena o farmacologica di non caratterizzate piccole molecole. Di conseguenza, il potenziale di screening della mosca embrione è stato sufficientemente sfruttato nella caratterizzazione di piccola attività molecola.
Consegna di piccole molecole per la mosca embrione può essere realizzato con due metodi: 1) permeabilizzazione del guscio e 2) microiniezione. Questo articolo presenta anticipi al metodo di permeabilizzazione che sono facili da eseguire nel contesto di un laboratorio tradizionale Drosophila. Va notato che i recenti progressi nei metodi microiniezione con tecnologia microfluidica contribuisce anche ai metodi di introdurre composti al 5,6 embrione. Introducendo molecole per l'embrione è impedito da uno strato ceroso del guscio 7. Il guscio Drosophila è costituito da cinque strati. Dal'esterno che sono: la membrana vitellina, lo strato ceroso, lo strato interno corionica, il endochorion e il exochorion 8. I tre strati corionica esterni possono essere rimossi breve emersione dell'embrione in candeggina diluita, un passo indicato come dechorionation. Lo strato ceroso esposto può essere compromesso dall'esposizione ai solventi organici, come eptano e ottano 7,9, rendendo l'embrione dechorionated permeabile, mentre rimane racchiusi nella membrana vitellina sottostante. Tuttavia, l'uso di tali solventi introduce complicazioni dovute alla loro tossicità e la difficoltà di regolare la loro forte azione permeabile, entrambi i quali hanno effetti negativi Stark vitalità dell'embrione 9,10.
Un metodo di permeabilizzazione utilizzando una composizione definita embrione permeabilizzazione solvente (EPS) è stato descritto in precedenza 1. Questo solvente costituito da d-limonene e tensioattivi di origine vegetale che consentono il solvente sia miscibldi e con tamponi acquosi. La bassa tossicità di d-limonene e la capacità di diluire il solvente a concentrazioni desiderate ha dato un metodo efficace per generare embrioni permeabili con alta vitalità 1. Tuttavia, due fattori endogeni hanno continuato a portare limitazioni all'applicazione. In primo luogo, gli embrioni dimostrano l'eterogeneità della permeabilità dopo il trattamento EPS, anche se si ha cura di mantenere una stretta messa in scena dello sviluppo. In secondo luogo, gli embrioni più vecchio di circa otto ore hanno dimostrato difficile da permeabilize, coerente con un indurimento del guscio che si verifica dopo la deposizione delle uova 11.
Descritto qui ci sono progressi nel metodo EPS che: 1) contribuire a individuare e analizzare gli embrioni quasi identico permeabilizzate, anche dopo il fissaggio e di immunoistochimica passi sono stati eseguiti e 2) consentire permeabilizzazione degli embrioni in punti ritardo dello sviluppo tempo (> 8 ore, palcoscenico 12 anni e più). In particolare, l'applicazione di un colorante rosso lontano,Acido carbossilico CY5, è descritto che funge da indicatore permeabilità, che persiste nell'embrione durante lo sviluppo e dopo fissazione con formaldeide. Inoltre, è dimostrato che l'allevamento embrioni a 18 ° C mantiene il guscio in uno stato sensibile EPS, consentendo permeabilizzazione di embrioni fase tardiva (fasi 12-16).
Questi progressi superare i limiti precedentemente menzionati alla metodologia EPS. Questa applicazione sarà quindi fornire agli investigatori un mezzo per introdurre piccole molecole di interesse per l'embrione in diversi momenti dello sviluppo, pur mantenendo la redditività.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo di cui sopra delinea un mezzo per ottenere embrioni di Drosophila vitali che sono accessibili ai piccoli trattamenti molecola attraverso una vasta gamma di sviluppo. Questo metodo presenta il romanzo e semplice constatazione che l'invecchiamento embrioni a 18 ° C permette di permeabilizzazione di embrioni in fase avanzata con la stessa efficacia, come visto in precedenza solo negli embrioni in fase iniziale. Inoltre, l'uso del colorante CY5 acido carbossilico lontano rosso come indicatore di …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).
Materials
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
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