Summary

Met behulp van fluorescerende eiwitten naar Monitor Glycosome Dynamiek in de Afrikaanse Trypanosoom

Published: August 19, 2014
doi:

Summary

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Abstract

Trypanosoma brucei is een kinetoplastid parasiet die humane Afrikaanse slaapziekte (HAT), of slaapziekte, en een slopende ziekte, Nagana veroorzaakt, bij runderen 1. De parasiet afwisselend de bloedbaan van de zoogdier gastheer en de tseetseevlieg vector. De samenstelling van veel cellulaire organellen verandert in reactie op deze verschillende extracellulaire condities 2-5.

Glycosomen zijn zeer gespecialiseerde peroxisomen waarin veel van de betrokken bij de glycolyse enzymen zijn gecompartimenteerd. Glycosome samenstelling verandert in een ontwikkelings-en milieuvriendelijke gereguleerde manier 4-11. Momenteel is de meest gebruikte technieken om glycosome dynamica te bestuderen zijn elektron en fluorescentiemicroscopie; technieken zijn duur, tijd en arbeidsintensief en niet gemakkelijk worden aangepast aan hoge doorvoer analyse.

Om deze beperkingen, een fluorescerende-glycosome reporter systeem in te overwinnendie geel fluorescerend eiwit (eYFP) meer gefuseerd aan een peroxisomen targeting sequentie (PTS2), waarbij het ​​fusie-eiwit glycosomen 12 verbindt, is vastgesteld. Bij de invoer van de PTS2eYFP fusie-eiwit, glycosomen geworden fluorescerend. Organel afbraak en recycling resulteert in het verlies van fluorescentie die kan worden gemeten door stroming cytometrie. Grote aantallen cellen (5.000 cellen / sec) kunnen in real-time worden geanalyseerd, matrixvoorbereiding zoals fixatie en bevestigingsmiddelen. Deze werkwijze biedt een snelle manier detecteren van veranderingen in organel samenstelling in reactie op wisselende omgevingsomstandigheden.

Introduction

Trypanosoma brucei veroorzaakt Afrikaanse slaapziekte bij de mens en een slopende ziekte, Nagana, bij runderen. Geneesmiddelen die worden gebruikt bij de behandeling van deze ziekten zijn verouderd en uiterst giftig, vaccins beschikbaar zijn, en het potentieel voor de ontwikkeling van resistentie vereist de zoektocht naar nieuwe drug targets 1.

Tijdens zijn levenscyclus, T. brucei, afwisselend een insect vector en zoogdiergastheer-; twee hosts die zeer verschillende omgevingen waarin de parasiet moet overleven presenteren. Een aantal metabolische en morfologische veranderingen optreden als de parasiet blootgesteld aan verschillende omgevingsomstandigheden. Enkele van de meest dramatische veranderingen zijn waargenomen bij enkele-membraan begrensd parasiet specifieke microlichamen, genoemd glycosomen 13.

Glucosespiegels zijn relatief hoog (~ 5 mM) in het bloed en bloed parasieten (BSF) genereren ATP uitsluitend via glycolyse while mitochondriale stofwisseling wordt onderdrukt 14. In tegenstelling tot andere eukaryoten waar glycolyse optreedt in het cytoplasma, T. brucei compartmentalizes meeste glycolytische enzymen in glycosomen 14,15. De parasieten worden door de tseetseevlieg tijdens een bloedmeel genomen en ervaren een daling in glucose, dat valt te stellen niveaus binnen 15 minuten te worden ingenomen door de vlieg. Het metabolisme van insecten, procyclische vorm (PCF), parasieten is flexibeler en glucose, alsook aminozuren zoals proline, kan worden gebruikt bij de synthese van ATP 16-18. Vergelijkende proteomics studies blijkt lifecycle afhankelijke veranderingen in glycosomal en mitochondriale eiwitten met glycolytisch eiwitten toegenomen in de bloedbaan parasieten en mitochondriale eiwitten die betrokken zijn bij de TCA-cyclus en respiratoire keten 13,19. Terwijl veel studies hebben zich gericht op de verschillen tussen de BSF en PCF glycosomen, is er weinig bekend over de veranderingen in de PCF glycosomen die optreden als reactie op environmental veranderingen.

In de dikke darm van de vlieg, het glucose laag is met een voorbijgaande verhoging tijdens een voeding 20. In de meeste in vitro studies, zijn PCF parasieten gekweekt in medium met glucose. Echter, recente studies hebben aangetoond dat PCF stofwisseling sterk verandert in reactie op de beschikbaarheid van 17 glucose. Aangezien glucose, proline opname en proline dehydrogenase activiteit verhogen 18. Deze verandering in het mitochondriaal metabolisme waarschijnlijk gepaard met een verandering in glycosome samenstelling en morfologie, maar dit is niet direct beoordeeld.

Elektron en fluorescentie microscopie worden gemeenschappelijke technieken gebruikt om glycosome dynamiek in T. brucei 2,21-24. Deze protocollen zijn tijd en arbeidsintensief, duur en moeilijk aan te passen om real-time studies hoge doorvoer protocollen. Om deze beperking te overwinnen, een tl-organel reporter systeem used naar organellen in zoogdiercellen en gist te bestuderen is aangepast voor gebruik in T. brucei 12.

Fluorescent organel reportersystemen zijn uitgebreid gebruikt in hogere eukaryoten zoals gist, planten en zoogdiercellen 25-27. In dergelijke systemen wordt een fluorescerend eiwit gefuseerd aan een aminozuursequentie die het eiwit aan specifieke organellen gericht. De afbraak en synthese van de beoogde eiwitten gemeten via fluorescentie en veranderingen in organel samenstelling worden gereflecteerd door veranderingen in cel fluorescentie.

Wanneer het open leesraam van versterkte geel fluorescent eiwit (eYFP) gefuseerd aan een type II peroxisomale targeting sequentie (PTS2) 12, wordt de PTS2eYFP eiwit invoer in rijpe, import-bevoegde glycosomen en fluorescentie kan worden gevolgd via flowcytometrie. Variaties in glycosome preparaat worden gereflecteerd door veranderingen in de cellulaire fluorescentie. Dit systeem kan helpen bij resolVing de mechanismen die het milieu veroorzaakte veranderingen in glycosome samenstelling te regelen.

Dit manuscript beschrijft de vorming van een glycosome reporter systeem PCF parasieten in combinatie met flowcytometrie om real-time glycosome dynamiek in levende parasieten volgen en een voorbeeld van hoe het is gebruikt om veranderingen in glycosome samenstelling volgen in reactie op verschillende omgevingen. Samengevat wordt glycosome samenstelling beïnvloed door extracellulaire glucose concentraties en passage van log-fase culturen in vers medium triggers veranderingen in glycosome samenstelling. Dit systeem kan worden aangepast om het dynamische gedrag van andere organellen in trypanosomen en andere parasieten bestuderen.

Protocol

1 Algemeen Trypanosoom Veehouderij Weeg vaste stoffen SDM79 media preparaat (Tabel 1). Bewaar bij 4 ° C in 50 ml conische of een hersluitbaar zakje. OPMERKING: Reagentia stabiel gedurende tenminste 6 maanden. Dooi foetaal bovine serum (FBS) in een 37 ° C waterbad, en meng die periodiek door inversie. OPMERKING: FBS ontvangen van de leverancier als een steriele oplossing. Filter steriliseren FBS verlaagt haar vermogen parasiet groei. Zodra de gehele fles wordt o…

Representative Results

In dit systeem werd een glucose-afhankelijke verandering in glycosome samenstelling waargenomen. Wanneer cellen worden gekweekt in glucose bevattend medium, worden twee populaties waargenomen; een lichte en een dim (Figuur 2A). Dim cellen haven onvolwassen glycosomen, die niet zijn geïmporteerd het PTS2eYFP terwijl heldere cellen herbergen een mix van rijpe en onrijpe glycosomen 12. Wanneer glucose aanwezig is in de media is, mislocalisatie van glycosome eiwitten is dodelijk 15,28…

Discussion

Glycosomen zijn essentieel, dynamisch, parasiet-specifieke organellen. De processen die de biogenese, onderhoud, proliferatie en verbouwing van deze organellen regelen waarschijnlijk ook drug targets die kunnen worden benut voor therapeutische doeleinden. Ondanks het potentieel hoge overvloed van deze targets, is het gebied van glycosome biogenese achterbleef het bestuderen van gelijkaardige processen in andere organismen, voornamelijk door het ontbreken van een soepel, high-throughput systeem waarbij snelle, dynamische…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by the Creative Inquiry Program for Undergraduate Research and the Calhoun Honors College at Clemson University.

Materials

Adenosine Avocado Research Chemicals Ltd A10781 SDM79 Ingredient
L-Alanine Avocado Research Chemicals Ltd A15804 SDM79 Ingredient
L-arginine CalBiochem 1820 SDM79 Ingredient
p-aminobenzoic acid ICN Biomedicals 102569 SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100X) Sigma B6891 SDM79 Ingredient
Biotin Fisher BP232-1 SDM79 Ingredient
Calcium Chloride VWR BDH0224 Cytomix
EDTA Fisher S311-100 Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit Omega Biotek D2500-01 DNA purifiation
Research grade Serum Fisher 03-600-511 SDM79 Ingredient
Folic acid ICN Biomedicals 101725 SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl ICN Biomedicals 194671 SDM79 Ingredient
Glucose GIBCO 15023-021 SDM79 Ingredient
L-glutamine CalBiochem 3520 SDM79 Ingredient
Glycerol Acros Organics Ac15892-0010 Freezing media
Graces insect cell media powder GIBCO 11300-043 SDM79 Ingredient
Hemin MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Guanosine Avocado Research Chemicals Ltd A11328 SDM79 Ingredient
HEPES MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Magnesium Chloride Fisher BP214-500 Cytomix ingredient
L-methionine Fisher BP388-100 SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50X) Cellgro 25-030-CI SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100X) Lonza 13-114E SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1X) with L-glutamine Cellgro 10-010-CM SDM79 Ingredient
MOPS Fisher BP308-500 SDM79 Ingredient
Sodium Biocarbonate Fisher S233-500 SDM79 Ingredient
Penicillin-Streptomycin Solution Cellgro 30-002-CI SDM79 Ingredient
L-phenylalanine ICN Biomedicals 102623 SDM79 Ingredient
Potassium Chloride Fisher P217-500 Cytomix ingredient
Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisheer P290-212 Cytomix ingredient
L-proline Fisher BP392-100 SDM79 Ingredient
L-serine Acros Organics 56-45-1 SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt Acros Organics 113-24-6 SDM79 Ingredient
L-taurine TCI America A0295 SDM79 Ingredient
L-threonine Acros Organics 72-19-5 SDM79 Ingredient
L-tyrosine ICN Biomedicals 103183 SDM79 Ingredient
E.Z.N.A.Cycle Pure kit Omega Biotek D6492-02 DNA purification
Binding buffer Omega Biotek PDR041 DNA purification
SPW wash buffer  Omega Biotek PDR045 DNA purification
Gene Pulser Xcell  Biorad 165-2660 Trypanosome transformation
4 mm electroporation cuvettes VWR Trypanosome transformation

References

  1. Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
  2. Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei. Autophagy. 4, 294-308 (2008).
  3. Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses. Autophagy. 2, 107-118 (2006).
  4. Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids. Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).
  5. Michels, P. A., et al. Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review). Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).
  6. Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target. FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).
  7. Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).
  8. Parsons, M. Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).
  9. Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae – new data and views. Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).
  10. Michels, P. A., Hannaert, V. The evolution of kinetoplastid glycosomes. J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).
  11. Hannaert, V., Michels, P. A. Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida. J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).
  12. Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome. Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).
  13. Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei. Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).
  14. Opperdoes, F. R. Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes. Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).
  15. Kessler, P. S., Parsons, M. Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase. The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).
  16. Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).
  17. Coustou, V., et al. Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei. The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).
  18. Lamour, N., et al. Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose. The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).
  19. Vertommen, D., et al. Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei. Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).
  20. Vickerman, K. Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes. British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).
  21. Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p. The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).
  22. Saveria, T., et al. Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes. Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).
  23. Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number. Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).
  24. Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. Identification and validation of Trypanosoma cruzi’s glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal. Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).
  25. Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).
  26. Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).
  27. Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation. Cell. 122, 85-95 (2005).
  28. Furuya, T., et al. Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).

Play Video

Cite This Article
Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).

View Video