This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.
In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner. Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.
Применение электрического тока в клетку приводит к образованию пор на клеточной мембране, с помощью процесса, называют электропорации. Поры обеспечивают прохождение различных nonpermeant молекул через мембрану. Электрическое поле может управляться точно, так что поры, образованные очень малы и быстро повторного, с минимальным нарушением к клеточной физиологии. Интересно, прилипшие клетки могут быть выращены на предметное стекло, покрытой проводящим и прозрачной оксида индия-олова (ITO) и электропорации на месте, то есть на поверхности, где они растут, не будучи оторванными быть электропорации в суспензии. Клетки могут расти очень хорошо на этой поверхности, и как они связаны и расширен, детальное микроскопическое наблюдение можно. При использовании этого метода, небольшие nonpermeant молекулы могут быть введены мгновенно и в по существу 100% клеток, что делает этот метод особенно подходит для исследований по активации компonents из тропе следующие лиганда стимуляции рецепторов (обзор 1).
Электропорация был использован в основном для введения ДНК (также называется electrotransfection). Тем не менее, электропорацию на месте может быть полезным для введения большого разнообразия молекул, таких как пептиды 2-4, олигонуклеотидов, таких как антисмысловой РНК, двухцепочечных олигонуклеотидов ДНК-ловушек для ингибирования связывания фактора транскрипции, и миРНК 3,5, 6, радиоактивные нуклеотиды 7-10, белки 11 12 или пролекарства 13. После электропорации клетки можно лизировать для биохимических анализов или фиксировали и окрашивали антителами.
Проводящий ITO покрытия является очень тонким, 800-1,000Å, таким образом, что рост клеток не нарушается по разнице в высоте двух поверхностей, как клетки растут по краю проводящего покрытия. Это дает то преимущество, что не-electropораторствовал клетки могут быть выращены бок о бок с электропорации те, в качестве контрольной группы. Тот же самый подход может быть использован для изучения зазора соединительного, межклеточных взаимодействий (GJIC), как описано в видео.
Щелевые контакты каналы, соединяющие интерьеры соседних ячеек 14. Зазор узловой, межклеточной коммуникации играет важную роль в формировании опухоли и метастаз, а онкогены, такие как Src подавить GJIC 15,16. Чтобы исследовать GJIC флуоресцентный краситель, такой как Lucifer желтый (LY) часто вводят в культивируемые клетки с помощью микроинъекции или царапать-нагрузку 17 и диффузии красителя в соседних ячеек под микроскопом наблюдали под флуоресцентным освещением. Эти методы, однако, неизменно вызывают повреждения клеток. Опишем технику, где клетки, выращенные на предметное стекло, которое частично покрытой ITO 18. Электрический импульс был применен в присутствии LY (или других красителей) чаиспользуя ее проникновение в клетки, растущие на проводящей части слайда, в то время как миграция красителя с соседними, не-электропорации клеток под микроскопом наблюдается через флуоресценции освещения. Чтобы не беспокоить чувствительные клетки, которые могут иметь тенденцию отделить от монослоя, сборка была разработана, что не требует электрод должны быть размещены в верхней части клеток для применения электрического тока 19. Этот подход дает возможность количественного GJIC в большом количестве клеток, без обнаруживаемого помех на клеточный метаболизм, как показано отсутствие эффекта от длины фазе G1 следующей сыворотки стимуляции 12, увеличение уровней ФОС протоонкоген белок (Raptis, не опубликовано) или две киназы, связанные с клеточным стрессом, р38 свиней или JNK / SAPK киназы 1. Такой подход сделал возможным изучение связи между уровнем экспрессии онкогенов, преобразования и ГДжИК 18, а также эффект Src и Stat3 на GJIC в различных типах клеток, в том числе клеток, культивированных из свежих опухолей легких образцов 20-23. Кроме того, на месте электропорации на установке, описанной в котором отсутствует верхний электрод успешно применяется для демонстрации закрытия щелевых контактов по adipocytic дифференциации, хотя сотовой крепления к подложке снижается на этом этапе 19,24.
Критические шаги в протоколе
Электропорации материал
Чистота материала, подлежащего электропорации является очень важным. Если клетки очень плоским, то более высокие концентрации красителя для отслеживания должны быть использованы (до 20 мг / мл в течение ю?…
The authors have nothing to disclose.
We thank Lowell Cochran for expert videography assistance. The financial assistance of the Canadian Institutes of Health Research (CIHR), the Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), the Canadian Breast Cancer Research Alliance, the Ontario Centers of Excellence, the Breast Cancer Action Kingston and the Clare Nelson bequest fund through grants to LR is gratefully acknowledged. SG was the recipient of an NSERC studentship. MG was supported by a postdoctoral fellowship from the US Army Breast Cancer Program, the Ministry of Research and Innovation of the Province of Ontario and the Advisory Research Committee of Queen’s University.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DMEM | Cellgro http://www.cellgro.com/ | 50-013-PB | |
DMEM without Calcium | Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) | SH30319-01 | |
Donor Calf Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# B15-008 | |
Fetal Bovine Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# A15-751 | |
Electroporation apparatus | Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ | ACE-100 | |
Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-04-CC | 4-wells |
Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-08-CC | 8-wells |
Lucifer Yellow | Cell Projects Ltd UK | ACE-25-LY | High purity |
CelTak | BD Biosciences | 354240 | Cell and tissue adhesive |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
Poly-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 |