Un ensayo funcional para Gap Junctional examen; La electroporación de células adherentes de indio-óxido de estaño
Summary
This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.
Abstract
In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner. Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.
Introduction
La aplicación de corriente eléctrica a una célula provoca la formación de poros en la membrana celular, mediante un proceso denominado electroporación. Los poros permiten el paso de una variedad de moléculas nonpermeant través de la membrana. El campo eléctrico puede ser controlada con precisión, de modo que los poros formados son muy pequeñas y volver a cerrar rápidamente, con la mínima perturbación a la fisiología celular. Curiosamente, las células adherentes pueden ser cultivadas en un portaobjetos de vidrio recubierto con óxido de indio-estaño conductora y transparente (ITO) y electroporación in situ, que está en la superficie donde crecen, sin ser individual para ser a electroporación en suspensión. Las células pueden crecer muy bien en esta superficie, y como están unidos y extendidos, la observación microscópica detallada es posible. Usando esta técnica, moléculas pequeñas nonpermeant se pueden introducir de forma instantánea y en esencialmente el 100% de las células, lo que hace esta técnica especialmente adecuada para estudios sobre la activación de un borradoronents de una vía después de la estimulación del ligando de un receptor (revisado en 1).
La electroporación se ha utilizado principalmente para la introducción de ADN (también llamado electrotransfección). Sin embargo, la electroporación in situ puede ser valiosa para la introducción de una gran variedad de moléculas, tales como péptidos, oligonucleótidos 2-4, tales como ARN antisentido, oligonucleótidos de doble cadena de ADN de señuelo para inhibir la unión del factor de transcripción, o siRNA 3,5, 6, 7-10 nucleótidos radiactivos, proteínas 11 12 o profármacos 13. Después de la electroporación, las células pueden ser lisadas para los análisis bioquímicos o fijaron y se tiñeron con anticuerpos.
El recubrimiento de ITO conductor es muy delgada, 800-1,000Å, de modo que el crecimiento celular no se ve perturbado por la diferencia de altura de las dos superficies, ya que las células crecen a través del borde del revestimiento conductor. Esto ofrece la ventaja de que no electropevaporaron células pueden ser cultivadas lado a lado con los electroporación, para servir como controles. El mismo enfoque se puede utilizar para el examen de la unión brecha, la comunicación intercelular (GJIC), como se describe en el vídeo.
Gap cruces son canales que conectan los interiores de células adyacentes 14. Unión Gap, la comunicación intercelular juega un papel importante en la formación de tumores y metástasis, mientras que los oncogenes tales como Src suprimen GJIC 15,16. Para examinar GJIC un colorante fluorescente como el amarillo Lucifer (LY) a menudo se introduce en células cultivadas a través de microinyección o raspar de carga 17 y la difusión del colorante en las células vecinas se observa microscópicamente bajo iluminación de fluorescencia. Estas técnicas, sin embargo, invariablemente causan daño celular. Describimos ahora una técnica donde las células se cultivan en un portaobjetos de vidrio que está parcialmente recubierto con ITO 18. Un pulso eléctrico se aplica en la presencia de LY (u otros colorantes) cautilizando su penetración en las células que crecen en la parte conductora de la corredera, mientras que la migración de colorante a las células adyacentes no se observó microscópicamente electroporación través de la iluminación de fluorescencia. Para evitar células sensibles perturbadores que pueden tender a separarse de la monocapa, un conjunto fue diseñado que no requieren un electrodo que se coloca en la parte superior de las células para aplicar la corriente eléctrica 19. Este enfoque ofrece la posibilidad de cuantificar la GJIC en un gran número de células, sin ninguna perturbación detectable con el metabolismo celular, como se indica por la ausencia de un efecto sobre la duración de la fase G1 después de la estimulación de suero 12, el aumento de los niveles de los fos proteína protooncogén (Raptis, inédito) o dos quinasas asociadas con el estrés celular, el cerdo p38 o JNK / SAPK quinasa 1. Este enfoque hace posible el examen de la relación entre los niveles de expresión de oncogenes, transformación y GJIC 18, así como el efecto de Src y Stat3 sobre GJIC en una variedad de tipos de células, incluyendo células recién cultivadas a partir de muestras de tumor de pulmón 20-23. Además, en la electroporación in situ con la configuración descrita que carece de un electrodo superior ha sido empleado con éxito para la demostración de cierre de brecha de la salida a la diferenciación adipocítico, aunque la unión celular al sustrato se reduce en esa etapa 19,24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos en el protocolo
Material de electroporados
La pureza del material que se va a electroporación es muy importante. Si las células son muy planas, se deben utilizar concentraciones más altas de entonces el colorante de seguimiento (hasta 20 mg / ml para LY) y en tales casos, la pureza es incluso más importante que en las células con una forma más esférica 1. Además LY han empleado una gran variedad de otros colorantes o moléculas non…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Lowell Cochran for expert videography assistance. The financial assistance of the Canadian Institutes of Health Research (CIHR), the Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), the Canadian Breast Cancer Research Alliance, the Ontario Centers of Excellence, the Breast Cancer Action Kingston and the Clare Nelson bequest fund through grants to LR is gratefully acknowledged. SG was the recipient of an NSERC studentship. MG was supported by a postdoctoral fellowship from the US Army Breast Cancer Program, the Ministry of Research and Innovation of the Province of Ontario and the Advisory Research Committee of Queen’s University.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Cellgro http://www.cellgro.com/ | 50-013-PB | |
| DMEM without Calcium | Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) | SH30319-01 | |
| Donor Calf Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# B15-008 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# A15-751 | |
| Electroporation apparatus | Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ | ACE-100 | |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-04-CC | 4-wells |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-08-CC | 8-wells |
| Lucifer Yellow | Cell Projects Ltd UK | ACE-25-LY | High purity |
| CelTak | BD Biosciences | 354240 | Cell and tissue adhesive |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Poly-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
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