Kültürlenmiş memeli hücrelerinde büyük çapta paralel Raportör Tahliller

Summary

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Abstract

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

Introduction

Büyük ölçekte paralel Raportör Tahliller (MPRA) DNA dizilerinin ^{1- 7} yüz binlerce binlerce transkripsiyonel düzenleyici faaliyetlerinin birden fazla mesaj göndermiş ölçümüne izin verir. En genel bir uygulamasında, çoklayıcı bir açık okuma çerçevesinin alt tanıtıcı bir dizi etiketi içeren bir sentetik raportör gene, ilgilenilen her sekansı birleştirilmesi ile elde edilir (ORF, Şekil 1). Transfeksiyon, RNA izolasyonu ve raportör gen transkriptlerinin 3 'uçları arasında derin dizilemesi sonra, birleştirilen dizilerin relatif aktiviteleri, bunların belirlenmesi etiketlerin görece bolluğu sonucu çıkarılabilir.

MPRA Şekil 1. Genel Bakış. MPRA raportör bir kütüphane sentetik varsayımsal düzenleme sekansları şekilde birleştirilmesi yoluyla yapılandırılır konstruktlarıtanımlayıcı bir dizi etiketi ve ardından (örneğin, lusiferaz, GFP ve gibi) bir "etkisiz" ORF oluşmaktadır raportör genler. Kütüphane kültürlenmiş hücrelerin bir popülasyonunun içine transfekte edilir topluca ve kopyalandığı raportör mRNA, daha sonra elde edilir. Derin sıralama muhabiri mRNAların ve nakledilen plazmidlerden arasında her etiket yineleme sayısını saymak için kullanılır. Plazmid sayısı ilgili düzenleyici dizi aktivitesini belirlemek için de kullanılabilir fazla mRNA oranı sayar. Melnikov izni ile uyarlanmıştır, ve ark ^2.

MPRA ilgi konusu bir lokus üzerinde yeni bir düzenleyici elemanlar için tek tek gen düzenleme elemanlarının 1) geniş mutajenezi, 2) tarama dahil olmak üzere deney tasarımları çeşitli adapte edilebilir, 3) farazi bir dizi doğal genetik farklılaşmasının etkisinin test edilmesi uyarıcının veya susturucular ve sentetik düzenleyici elemanlar 4) yarı-rasyonel mühendislik. Lidizi varyantlarının braries dejenere oligonükleotidler ^1,4, birleştirici ligasyon ⁸ ve genomik DNA ⁵ parçalanma oligonükleotid mikrodiziler kütüphane programlanabilir ^2,3,6,7 üzerinde sentezi (en küçük kareler), montaj dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak elde edilebilir.

Bu protokol, promotör bir kütüphanesinin yapımını da tarif eder varyantlarının en küçük kareler ve pMPRA1 ve pMPRAdonor1 vektörleri (sırasıyla Addgene kimlikleri 49349 ve 49352; http://www.addgene.org) kullanılarak kültürlenmiş memeli hücrelerine ve daha sonra kantitatif olarak bu kütüphanenin geçici transfeksiyon ilişkili etiketleri derin sıralama (Etiket-Dizi) tarafından promotör faaliyetleri. Bu protokolün önceki sürümleri (2013) Araştırma 23, 800-811 Melnikov ve ark. Nature Biotechnology 30, 271-277 (2012) ve Kheradpour ve ark. Genome bildirilen araştırmada kullanılmıştır.

Protocol

1. Dizi Tasarımı ve Sentezi Dizilerin tasarımı ve sentezi ile başlar MPRA düzenleyici aktivitesi için tahlil edilecek. PMPRA vektör serisi ile uyumluluk için, aşağıdaki şablonu kullanarak her sekansı tasarımı: 5'-ACTGGCCGCTTCACTG- var -GGTACCTCTAGA- etiketi -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 var denenecek diziyi temsil eder ve etiketi bir veya daha tanımlayıcı etiketleri gösterir '. Iki değişken bölgeleri (var ve etiket) aralarında bir raportör gen fragmanının ligasyonu yönsel kolaylaştırmak için Kpnl (GGTACC) ve Xbal (TCTAGA) kısıtlama sitelerinin bir çift ile ayrılır. Buna ek olarak, iki ayrı Sfil (GGCCNNNNNGGCC) siteleri pMPRA omurgasına yönlü bağlanmasını sağlamak için, PCR ile eklenir. Bu değişken bölgeler restriksiyon siteleri ek kopyalarını içermemelidir. Gerekirse, bu sınırlama enzimlerinin bir veya daha fazla ikame edilmiş olabilir, Uzun ve yedek olarak 1) yakın bir DNA moleküllerinin uçları etkili kesme sağlar, ve 2) vektör dizisi dışında kesme. Ek ayrıntılar için Tartışma bakın. Ticari bir satıcıdan Tablo 1'de listelenen gerekli primerler elde edilir. MPRA_SfiI_F GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG MPRA_SfiI_R GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC TAGseq_P1 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TAGseq_P2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [index] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG Tablo 1. Primer dizileri. [Index] çoğullanmış dizileme için kullanılan bir 6 ila 8 nt endeksi diziyi temsil eder. Farklı endeksleri ile en az 8 TagSeq-P2 primerler edinin. TümPrimerlerin HPLC veya PAGE ile arındırılmalıdır. Oligonükleotid kütüphaneler ticari bir satıcıdan veya çekirdek tesisinden elde edilen, ya da üretici tarafından tarif edildiği gibi, bir programlanabilir mikro-dizi-bazlı oligonükleotit sentezleyici kullanılarak üretilebilir. 100 ul TE 0.1 tamponunda EKK ürünleri süspanse. Denatüre edici poliakrilamid jel% 10 TBE-Üre üzerinde oligonükleotid kütüphaneleri çalıştırın. Kalite (Şekil 2A) değerlendirmek için ssDA duyarlı floresan boyası ile şeritli ve leke başına yaklaşık 1 pmol yükleyin. Tam uzunlukta oligonükleotitlerin karşılık gelen ayrı bir bant görselleştirilebilir durumunda (Şekil 2A, kulvarlar 1 ve 2), karşılık gelen akrilamid jel dilim kesip ve çalkalama ile oda sıcaklığında gece boyunca 100 ul TE 0,1 oligonükleotitlere aynlır. Aksi takdirde, en küçük kareler ham süspansiyonu kullanılarak devam edin. Yükseltmek ve PCR 9 emülsiyonu kullanılarak oligonükleotid kütüphaneye Sfil kuyrukları eklemek </> sup. Tablo 2'de tarif edildiği gibi 50 ul PCR reaksiyon karışımları ayarlayın. Daha sonra 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 ul DNA, Micellula Emülsiyon yağ ve yüzey aktif madde karışımı ile saflaştırma kiti ve vorteks ile birleştirir. Reaktif 1x Hacmi (ul) Herculase II Füzyon DNA Polimeraz 0.5 5x Herculase II Reaksiyon Tamponu 10 dNTP (10 mM) 1.25 BSA (20 mg / ml) 1.25 Astar MPRA_SfiI_F (25 uM) 0.25 Astar MPRA_SfiI_R (25 uM) 0.25 EKK şablonu (1-10 attomol) değişir Nükleazlar içermeyen su 50 ve_content "> Tablo 2. Emülsiyon PCR reaksiyon karışımı (su fazı). Eser ortaya çıkmadan amplifikasyon ürünlerinin azami bir verim sağladığını konsantrasyonunu kullanarak (bölüm 1.12 bakınız). PCR tüpleri içine koyun ve elde edilen emülsiyonun 95 ° C (2 dakika, 20 PCR döngüsünden yerine, 20 cm x [95 ° C'de 20 saniye, 55 ° C, 72 ° C de 30 sn 20 sn], 95 ° C'de 3 dakika ° C). Havuz vorteks kısa bir süre 1 mi izobütanol ilave edilmesi ve her bir 350 ul emülsiyon PCR reaksiyonunu kırmak, ve daha sonra bir DNA arıtma kolonu kullanılarak amplifikasyon ürünün arıtılması ve. Artifakt amplifikasyon (Şekil 2B) kontrol etmek için bir% 2 veya% 4 agaroz jel üzerinde bir kesir çalıştırın. Oligonükleotit sentezi kütüphanelerinin Şekil 2. hazırlanması a.) </strong> Üç farklı ham oligonükleotid sentezi kütüphaneleri (EKK)% 10 TBE-Üre poliakrilamid jelleri üzerinde çalıştırın. Tam uzunlukta oligonükleotitlerin (*) karşılık gelen bantları görsel ve kütüphanelerden 1 den kesilmiş ve 2. Library 3 SAYFA arıtma müdahale kontaminatlar edilebilir. Bu durumda ise, bir agaroz jel üzerinde, aynı oligonükleotid kütüphane çalışmasının açık ve emülsiyon PCR amplifikasyonu PCR amplifikasyonu. Ürünler, b) doğrudan devam edin. Karmaşık oligonükleotid kütüphanelerin PCR sık kimerik ürünler ve daha yüksek ve daha düşük bantları gibi görünebilir diğer eserler oluşturur. Emülsiyon PCR, bu eserler en aza indirebilirsiniz. 2. Kütüphane İnşaatı , Bir% 1 agaroz jel üzerinde yapılmıştır, 2 saat için, 50 ° C de bir Sfil ile sindirilerek vektör pMPRA1 ile doğrusallaştırılmış plazmit omurga hazırlanması (Bu durumda, 2,5-kb olarak) bant kesip omurga ve bir jel saflaştırma spin-sütunu kullanarak arıtın. Digest2 saat boyunca 50 ° C'de bir Sfil ile adım 1.4 emülsiyon PCR ürünleri ve DNA saflaştırma kolonları kullanılarak saflaştırılması. , Doğrusallaştırılmış vektör omurgasına promotör-etiketi kitaplığı birbirine bağlamak için sindirilmiş PCR ürünü, 100 ng, lineerize vektör omurgası ve T4 DNA ligazı ihtiva eden 50 ng tepkileri oluşturmuştur. 20 dakika ligazı inaktivasyonu için 65 ° C sıcaklıkta daha sonra ısı 16 ° C de bir gece inkübe ve. E. Transform Ligasyon reaksiyonu E. coli ile. Kütüphane karmaşıklığı korumak için, tasarlanan kütüphanede farklı promotör-etiketi kombinasyonları vardır en az 10x daha cfu elde etmek hedefliyoruz. Etiketler toplam sayısı yaklaşık 100,000 olduğunda, tipik haliyle, hedef CFU kütüphane başına 6-8 paralel dönüşümlerinin gerçekleştirilmesi suretiyle elde edilebilir. Her bir dönüşüm, E. elektrouyumlu 50 ul birleştirme Buz üzerinde ligasyon karışımı 2 ul E. coli hücreleri. 800 ul SOC hücreleri elektroporasyon ile transforme kurtarmakParalel dönüşümler hücreleri birleştirir sonra 1 saat boyunca 37 ° C'de çalkalanarak ve orta tarafından. Transformasyon etkinliğini değerlendirmek için, 50-100 ug / ml karbenisilin LB agar plakaları üzerinde elde edilen hücreler bir alinquot kadar seri seyreltiler plaka ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. / V V v ve elde edilen hücreler toplam hacmi olan seri seyreltiler için alınan kan hacmi olan – toplam CFU olarak (gözlenen cfu), x (seyreltme faktörü) x (v V) tahmin edilmesi. Aynı zamanda, geri kalan hücrelerin 100 ug / ml karbenisilin ile desteklenmiş 200ml LB aşılamak için kullanılır. Çalkalamalı bir inkübatör içinde gece boyunca 37 ° C'de hücrelerin büyümesine ve sonra standart yöntemler kullanılarak, plazmid DNA izole eder. 2 saat boyunca 50 ° C'de bir Sfil ile izole edilen plazmid kütüphanesinin bir kısım sindirimi ve insertlerin varlığı teyit etmek için bir% 1 agaroz jel üzerinde yapılmıştır. C plazma kütüphanesi linearizeKpnl ve Xbal kullanarak promotör varyantları ve etiketleri arasında esme. Sindirim verimliliğini maksimize etmek için, seri sindirimler gerçekleştirin: İlk olarak, 1 saat boyunca 37 ° C'de Kpnl ile sindirmek ve manyetik boncuklar kullanılarak saflaştırılması. İkinci olarak, 2 saat boyunca 37 ° C 'de, 1 U karides alkalin fosfatazı ilavesiyle Xbal ile sindirilmesi, ısı 5 dakika boyunca 65 ° C'de etkisiz hale ve daha sonra manyetik boncuklar kullanılarak saflaştırılması. Tam doğrusallaştınlmasının kontrol etmek için bir% 1 agaroz jeli üzerinde bir kesir çalıştırın. Kesilmemiş plazmid görülebiliyorsa, doğrusallaştırılmış fragmanı jel arındırılmalıdır. Memeli hücreleri içine transfeksiyonu için uygun bir MPRA kütüphanesi oluşturmak için, ara doğrusallaştırılmış kitaplığa Kpnl / Xbal uçları ile uyumlu bir bir ORF ligate. PMPRAdonor1 uyumlu bir luc2 ORF fragmanını hazırlamak için, 1 saat boyunca 37 ° C'de Kpnl ve Xbal ile sindirimi plasmid ve bir% 1 agaroz jel üzerinde yapılmıştır. ORF parçasını kesip (1.7 kBu durumda, b) ve bir jel saflaştırma spin kolon kullanılarak saflaştırılması. 2,3-2,8 adımda tarif edildiği gibi doğrusallaştırılmış ara kitaplığa ORF parçası, klon. 1 saat boyunca 37 ° C'de Kpnl ile MPRA kütüphanenin (1-2 ug tekabül eden) bir tümbölen sindirmekte ve ürünleri bir% 1 agaroz jel üzerinde yapılmıştır. Sindirilmiş kütüphane tek bir bant olarak çalışıyorsa, ilave bantların (tipik olarak ara yapıların taşınmadan karşılık gelir), kütüphanesi aşağıdaki gibi bir daha antılabilir gözlenirse, Bölüm 3. edin: 1 saat boyunca 37 ° C'de Kpnl ile kirlenmiş kütüphanenin 3-5 ug sindirimi ve 4 ° C'de gece boyunca,% 0.8 agaroz jel üzerinde yapılmıştır. , Doğru kitaplığı grubu kesip çıkarmak jel saflaştırma spin kolon kullanılarak DNA'nın arıtılması ve 1 saat boyunca 37 ° C 'de yüksek konsantrasyonlu T4 DNA ligazı kullanılarak kendi kendine bağlanmasını gerçekleştirmek. Adım 2.8 'de açıklandığı gibi Sonra dönüşüm ve nihai kütüphane DNA izolasyonu tekrarlayın. 3. Transfection, Perturbasyon, ve RNA İzolasyonu Her bir bağımsız transfeksiyon, kültür, uygun bir ortam içindeki hücre istenilen sayıda (MPRA kütüphane karmaşıklığı ile tespit edildiği üzere, Tartışma) için. Örneğin DMEM kültür HEK293T / 17 hücreleri,% 10 FBS ve L-glutamin / penisilin / streptomisin ile takviye edilmiştir. Her bir kütüphaneden ve deneysel koşul için en azından iki bağımsız Transfeksiyonlar için kültür hücreleri. MPRA plazmid ile kültürlenmiş hücrelerin transfekte. Transfeksiyon yöntemi ve koşulları, her hücre tipi için optimize edilmelidir. Her transfekte edilmiş bir örnek için, eşleştirilmiş bir kontrol olarak plazmid DNA bir kısım (50-100 ng) muhafaza eder. Örneğin, 0.5 x 10 7 HEK293T / yetişen 17 hücrelerini transfekte etmek için 30 ul ul Lipofektamin LTX'i ve 10 ul Plus tepkin maddesi kullanılarak İndirgenmiş Serum Ortamı 1 mi Opti-MEM içinde 10 ug plazmit DNA'sı ile 10 cm'lik bir kültür kabı içinde% 50 birleşir. 5 saat sonra transfeksiyon karışımı çıkarın ve sağlarhücreler 24-48 saat kurtarmak için. İsteğe bağlı olarak, tasarlanan kütüphanede, bağlama veya sinyal bağımlı düzenleyici sekansları aktif hale getirmek için gerekli olan herhangi bir karışıklığa gerçekleştirin. Hücreler hasat ve üreticinin talimatlarını kullanarak standart oligo (dT) selüloz sütunları veya boncuklar kullanılarak poli (A) + mRNA izole eder. Sütun veya boncukların maksimum bağlama kapasitesi Toplanan hücrelerden mRNA beklenen toplam miktarını aşan emin olun. Örneğin, bölüm 3,3 beklenen verim yaklaşık 0,5-2,5 mikrogram mRNA. 4. Etiket-Sıra Transfekte edilmiş hücre lizatları vektör DNA taşınmasını ortadan kaldırmak için, önceki 2.4 ul turbo DNaz inaktivasyonu reaktifi, 1 saat boyunca 37 ° C 'de 1 ul Turbo DNaz (2 U) ve 2.3 ul 10x turbo DNaz tampon maddesi ile her biri 20 ul numune mRNA'sı tedavi eklemek RT daha sonra 5 dakika karıştırma ile, 90 saniye boyunca 10,000 g'da santrifüj ve bir tüpe olarak solüsyon. Doğrulayın bir agaroz jeli üzerinde ürün mRNA'nın her numunenin 60-100 ng bölüm 4.6 de tarif edildiği gibi PCR yapılması, ve daha sonra çalıştırarak saflık. (Luc2 ile pMPRA1 kullanıyorsanız 0.25 kb) özel amplikonlar görünmüyorsa, sütun tedavi mRNA arındırmak ve ardından Dnaz tedaviyi tekrarlayın. , Etiket-Dizi sıralama kütüphaneleri oluşturmak cDNA'sına muhabiri mRNA dönüştürmek ve PCR ile dizileme bağdaştırıcısı eklemek. Tablo 3'te tarif edilen mRNA / RT primer karışımları ayarlayın. Sonra buz üzerine yerleştirin, 5 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edilir. Tablo 4'te tarif edildiği gibi paralel olarak, cDNA sentez reaksiyonları ayarlayın. Reaktif 1x Hacmi (ul) mRNA numunesi (400-700 ng toplam) 8 Oligo 0DT (50 uM) 1 dNTP (10 mM) 1 cDNA sentezi için ove_content "> Tablo 3. RNA / Ters transkripsiyon primer karışımını içerir. Reaktif 1x Hacmi (ul) 10x SuperScriptTM III RT Tampon 2 MgCI2 (25mM) 4 DTT (0.1 M) 2 RNaseOut (40 U / ml) 1 Üst Simge III (200 U / ml) 1 Tablo 4. cDNA sentez reaksiyon karışımı. Yavaşça mRNA / RT primer cDNA sentezi karışımları ile karışır birleştirir. 50 dakika sonra, 5 dakika boyunca 85 ° C boyunca 50 ° C'de inkübe edilir ve daha sonra buz üzerine yerleştirin. Son olarak, 20 dakika boyunca, 37 ° C'de 2 U ribonükleaz H kuluçkalayın. 4-6 ul, Tablo 5'te tarif edildiği gibi PCR reaksiyonları ayarlamaReaksiyon karışımı, bir cDNA ya da şablon olarak 50 ng raportör plazmid. Daha sonra PCR amplifikasyonu (2 dakika boyunca 95 ° C, 26 x [30 saniye için 95 ° C, 30 sn için 30 saniye boyunca 55 ° C, 72 ° C], 3 dakika boyunca 72 ° C) gerçekleştirir. Reaktif 1x Hacmi (ul) 2x PfuUltra II HotStart PCR Master Mix 25 Astar TagSeq_P1 (25 uM) 0.5 Astar TagSeq_P2 (25 uM) 0.5 Şablon (mRNA, cDNA ya da plazmid DNA karışımı) değişir Nükleazlar içermeyen su 50 Tablo 5. Etiket-Dizi PCR reaksiyon karışımı. % 2 agaroz jeli içinden PCR ürünlerini çalıştırın Etiket-Seq kütüphane karşılık gelen amplikonun tüketim bantları (0.25 kb kullanılıyorsaluc2 ile pMPRA1) ve bu kullanılarak jel saflaştırma spin sütunları arındırmak. Yüzme havuzu, denatüre ve Illumina sıralama alet ile direkt olarak saflaştırılmış Etiket-Dizi amplikonları sırası. Filtre düşük kaliteli sıralı etiketi içinde daha az 30 puan veya b) tam bir dizayn etiketi eşleşmiyor bir Phred kalitesi ile bir veya daha fazla pozisyon içeren) tüm a kaldırarak okur. Kalan her etiketi, her kütüphanede görünür sayısını sayın. TPM (milyon başına dizilenmiştir etiketleri etiketler) etiket sayısını normalize ve dizileme kütüphanelerinin her çifti için plasmid türevli etiket sayısı fazla mRNA, türetilmiş etiket sayımı oranı hesaplanır. Birden fazla farklı etiketler, her sekans varyantının bağlantılı olsaydı, alt analizi için medyan oranlarını kullanın.

Representative Results

MPRA yüksek çözünürlüklü, transkripsiyonel düzenleyici elemanlarının dizi-etki ilişkileri kantitatif diseksiyon kolaylaştırır. Başarılı bir MPRA deney tipik olarak transfekte kitaplığı (Şekil 3A) dizilerin çoğunluğu için yüksek ölçüde tekrarlanabilir ölçümleri sağlayacaktır. Zayıf tekrarlanabilirlik (Şekil 3B) gözlenirse, bu durum, test dizileri arasında 1) düşük bir mutlak aktivitesi, ya da 2) düşük transfeksiyon verimi birine, geri kazanılan RNA örnekleri raportör mRNA, çok düşük bir konsantrasyonda bir göstergesidir. Şekil 4, analiz etmek sureti ile üretilen bir temsili "bilgi izi" 1,2 gösterir ~ ya da Sendai virüsü maruz kalmadan HEK293 hücrelerinde insan IFNB geninin üst akışında bir 145 bp dizisinin rastgele 37000 varyantları. Promotör TATA-kutu ve bilinen yakın güçlendirici 10 açık bilgi açısından zengin Regi olarak tanımlanabilirbir virüs-bağlı bir şekilde ortaya koymuşlardır. Şekil 3. Etiket-Dizi tekrarlanabilirlik. Yüksek (A) ve düşük (B) tekrarlanabilirlik ile iki bağımsız çoğaltmak transfeksiyonlann Etiket-Sıra verilerden örnekler gösteren Dağılım araziler. İkincisi arsa iki çoğaltır sadece birinde yüksek mRNA sayıları ile birçok Aykırı etiketleri gösterir. Bu tür yapılar, tipik olarak, raportör mRNA'ların konsantrasyonu nedeniyle raportör yapılan arasında düşük mutlak aktiviteler, veya düşük transfeksiyon verimi için, ya da kantitatif PCR amplifikasyonu için çok düşük olduğunu göstermektedir. Insan IFNB transkripsiyon başlama alanı ile yakın arttırıcının Şekil 4. bilgi izi. </strzun> yukan insan IFNB geninin bir 145 nükleotid (nt) bölgesi yaklaşık 37,000 rastgele varyantları, (A) ve Sendai virüsü (B) maruz kalmayan HEK293 hücrelerinde MPRA kullanılarak tahlil edilmiştir. Mavi çubuk her pozisyondaki raportör çıkışı ile nükleotid arasındaki karşılıklı bilgileri gösterir. Proksimal arttırıcı ve TATA kutusu viral enfeksiyon üzerinde yüksek bilgi içeriği bölgeleri olarak öne çıkıyor.

Discussion

MPRA is a flexible and powerful tool for dissection of sequence-activity relationships in gene regulatory elements. The success of MPRA experiments depend on at least three factors: 1) careful design of the sequence library, 2) minimization of artifacts during amplification and cloning, and 3) high transfection efficiency.

The possible lengths of the variable regions in the reporter constructs are largely determined by the synthesis or cloning technology used. Standard OLS is generally limited to about 200 nt, but this protocol is compatible with inserts up to at least 1,000 nt. Note that variable regions that are highly repetitive or contain strong secondary structures may end up underrepresented due to PCR and cloning biases. The length of the tags that identify each of the variable regions should be 10-20 nt and the collection of tags should ideally be designed such there are at least two nucleotide differences between any pair. Tags that contain the seed sequences of known microRNA or other factors that might influence mRNA stability should also be avoided when possible.

A key parameter in the design of MPRA experiments is the total number of distinct reporter constructs to be included in the library (the design complexity, denoted C_D). In practice, C_D is limited by the number of cultured cells that can be transfected. As a rule of thumb, the total number of transfected cells should be at least 50-100 times greater than C_D. For example, if 20 million cells can be transfected with a transfection efficiency of 50%, then C_D should be no more than ~200,000. Note that C_D is equal to the number of distinct regulatory sequence variants multiplied by the number of distinct tags per sequence. The more distinct tags are linked to each regulatory sequence, the more accurate the estimate of the activity of that sequence can be made (because measurements from distinct tags can be averaged), but the fewer distinct variants can be assayed in one experiment. The optimal choice depends on the experimental design. In a simple “promoter bashing” experiment, where a mathematical model will be fitted to the aggregated measurements, a single tag per variant is usually sufficient. In a screen for single-nucleotide polymorphisms that cause changes in regulatory activities, it may be necessary to use 20 or more tags per allele to obtain statistically robust results, because comparing each pair of alleles requires a separate hypothesis test.

If the sequences to be assayed are not expected to contain transcription start sites, a constant promoter can also be added in the same fragment. For example, pMPRAdonor2 (Addgene ID 49353) includes a minimal TATA-box promoter that is useful when the upstream variable region is expected to have significant enhancer activity, while pMPRAdonor3 (Addgene ID 49354) includes a modified, strong SV40 viral promoter that is useful when the variable region is expected to contain silencer activity or other negative regulatory elements.

Raw OLS products often contain a significant fraction of truncated oligonucleotides. These may interfere with accurate PCR amplification of the designed sequences, particularly when there is significant homology between them. Using PAGE purification to remove truncated synthesis products and emulsion PCR to minimize amplification artifacts are effective techniques for ensuring high library quality. If either step is impractical, it is imperative to minimize the number of PCR cycles used at each amplification step. Selection and expansion of the cloned library in liquid culture is generally sufficient to maintain the design complexity, but if recombination-prone vectors are to be used or significant representation bias is observed, the recovered cells can instead be plated directly onto large LB agar plates, expanded as individual colonies and then scraped off for DNA isolation. It is also important to consider the potential impact of synthesis errors, which are typically found at a rate of 1:100-500 in OLS. Full-length sequencing of the reporter constructs prior to transfection is recommended to identify and correct for such errors.

It is not necessary to introduce reporter constructs into every cell in the transfected culture, but transfection efficiencies below ~50% may lead to poor signal to noise ratios. It is advisable to optimize transfection conditions prior to performing MPRA experiments in a new cell type. When working with hard-to-transfect cell types, MPRA signals can be boosted by pre-selecting transfected cells. The pMPRA vector series includes variants that constitutively express a truncated cell surface marker that can be used to physically enrich for transfected cells prior to RNA isolation (for example, Addgene IDs 49350 and 49351).

Materials

Oligonucleotide library synthesis	Agilent, CustomArray or other OLS vendors	custom	If using OLS construction method
pMPRA1	Addgene	49349	MPRA plasmid backbone
pMPRAdonor1	Addgene	49352	luc2 ORF donor plasmid
TE 0.1 Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)	Generic	n/a	OLS buffer
Novex TBE-Urea Gels, 10%	Life Technologies	EC6875BOX	PAGE purification of OLS products
Novex TBA-Urea Sample Buffer	Life Technologies	LC6876	PAGE purification of OLS products
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies	S-11494	PAGE purification of OLS products
Micellula DNA Emulsion & Purification Kit	EURx/CHIMERx	3600-01	Library amplification by emulsion PCR
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent	600675	Polymerase for emulsion PCR
SfiI	New England Biolabs	R0123S	Library cloning with pMPRA vectors
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S	Library cloning with pMPRA vectors
XbaI	New England Biolabs	R0145S	Library cloning with pMPRA vectors
T4 DNA Ligase (2,000,000 units/ml)	New England Biolabs	M0202T	Library cloning with pMPRA vectors
One Shot TOP10 Electrocomp E. coli	Life Technologies	C4040-50	Library cloning with pMPRA vectors
LB agar and liquid media with carbenicllin	Generic	n/a	Growth media for cloning
E-Gel EX Gels 1%	Life Technologies	G4010-01	Library verification and purification
E-Gel EX Gels, 2%	Life Technologies	G4010-02	Library verification and purification
MinElute Gel Extraction Kit	Qiagen	28604	Library and backbone purification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Library DNA isolation
Cell culture media	n/a	n/a	Experiment-specific
Transfection reagents	n/a	n/a	Experiment-specific
MicroPoly(A)Purist Kit	Life Technologies	AM1919	mRNA isolation
TURBO DNA-free Kit	Life Technologies	AM1907	Plasmid DNA removal
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Life Technologies	18080-051	cDNA synthesis
PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix	Agilent	600850	Polymerase for Tag-Seq PCR
Primers (see text)	IDT	custom	PAGE purify Tag-Seq primers