Isolamento de Murino Linfonodo células estromais
Summary
Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.
Abstract
Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.
Introduction
Os linfonodos são compartimentos especializados onde as respostas imunes adaptativas contra-antígenos próprios estrangeiros e são iniciadas e coordenadas. O processo aqui apresentado descreve uma digestão enzimática curto combinado com pipetagem automatizada mecânica para obter linfonodo suspensão de células individuais e obter acesso às células viáveis do estroma de nódulos linfáticos, que mantêm a expressão de várias moléculas da superfície.
Formar células do estroma linfonodo cadafalso do linfonodo e cumprir três funções principais: primeiro eles filtram líquidos do corpo para provar antígenos, patógenos e sua patógeno padrão molecular associado (PAMPs), bem como as citocinas e perigo associado padrão molecular (amortece) presente no corpo. Em segundo lugar, eles atraem e instruir as células apresentadoras de antígenos (APC) e linfócitos para interagir e iniciar respostas imunes adaptativas; e em terceiro lugar, que proporcionam um ambiente estrutural para a homeostase e diferenciação dos linfócitos 1-3. Durante a inflamação células do linfonodo estromais produzem fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas, adaptar-se, assim, o inchaço organizar a interação entre células dendríticas (DCs), T e células B. A orquestração das respostas imunitárias só é possível devido a arquitectura estrutural complexo formado por diferentes populações de células do estroma.
As células do estroma de nódulos linfáticos são células CD45 negativas e pode ser distinguida da expressão de CD31 ou gp38 em células fibroblásticas e endoteliais 1 -6. GP38 + CD31 – define as células da zona T reticulares (TRC, também conhecidos como FRC: células fibroblásticas reticulares), gp38 + CD31 + define células endoteliais linfáticas (LEC), gp38 – CD31 + define as células endoteliais do sangue (BEC). Além disso, a caracterização das subpopulações revelou a existência de outras células do estroma de nódulos linfáticos. De facto, uma pequena população de células-pericyte como foi caracterizado nagp38 – CD31 – população 7. Portanto, a adaptação do procedimento de isolamento é vantajosa para a identificação e caracterização das propriedades funcionais diferentes de células do estroma de nódulos linfáticos.
Antes do desenvolvimento de linfonodo células estromais digestão protocolos que o estudo de células estromais de linfonodos foi limitado a observações in situ usando secção de tecido e microscopia. No entanto, estudos estruturais e funcionais apresentaram características importantes de células estromais de linfonodos. As células do estroma de nódulos linfáticos são associados com podoplanina, colagénio e proteínas (ECM) de matriz extracelular de modo a formar uma estrutura tridimensional complexa 3 chamado sistema de conduta, a qual transporta as proteínas linfáticas e massa molecular associada menor do seio subcapsular do nó de linfa para o alto endotélio vênulas na zona de células T 8. DCs estão em contato com células do estroma e pode ser observado saliente no con tubularestrutura duit a amostra de fluido e detectar antigénios 8. A interação das células do estroma dos nódulos linfáticos (TRCs e LECs) com DCs é mediada pela liberação e apresentação das quimiocinas CCL21 e CCL19 9,10. CCL19 e CCL21 são reconhecidos pelo receptor CCR7 facilitar DCs e as células T migrem para a zona das células T linfonodo 4,11. Apesar de usar quimiocinas semelhantes, as células T e DCs têm diferentes rotas de migração para os linfonodos 12. Mais tarde, utilizando a digestão enzimática do nódulo linfático e isolamento de células do estroma de nódulos linfáticos puros, estudos funcionais foram realizados sobre o papel dos diferentes células do linfonodo estroma e a sua capacidade para interagir com DC e células T / B 6,13. Em primeiro lugar, a interferência entre as células produtoras de IFN-T efectoras e células estromais γ nódulos linfáticos induz a produção do óxido nítrico metabolito mostrado para amortecer as respostas das células T e a proliferação dos órgãos linfóides secundários 14-16. Em segundo lugar, n linfaAs células do estroma ode ter sido relatado para suportar a diferenciação de subconjuntos de DC de regulação através da produção de IL-10, 17, e para modular a homeostase da célula T ingénuos através da produção de IL-7 6,18. Em terceiro lugar, a expressão de TLR em células do estroma de nódulos linfáticos sugerem que as células do estroma são susceptíveis ao sinal obtido a partir de uma infecção ou de auto-moléculas libertado durante a lesão de tecidos. De facto, o tratamento de células do estroma de nódulos linfáticos com o ligando de TLR3 de poli (I: C) induz uma regulação positiva modesta de grande expressão de histocompatibilidade classe I e complexa regulação positiva da molécula co-inibidor PD-L1, mas não das moléculas de co-estimulação, resultando em mudanças dramáticas no tecido periférico antígenos expressão 19. Diversos grupos têm apontado células do estroma dos nódulos linfáticos expressar antígenos de tecidos periféricos e induzir tolerância das células T auto-reactivas 19,21-27. Portanto, a compreensão das interacções entre células do estroma dos nódulos linfáticos e outro re migratório ecélulas do linfonodo sident vai ajudar a encontrar novas moléculas alvo para permitir a ativação ou supressão de respostas imunes durante a inflamação. Portanto, é necessária a implementação da separação enzimática publicado do linfonodo.
Protocolos previamente publicados usar diferentes combinações de digestão enzimática à base de colagenase com baixo esforço mecânico 6,19,20. No entanto, longas incubações com enzimas da digestão ou a combinação de diferentes tipos de enzima de digestão pode prejudicar várias moléculas de superfície necessárias para analisar o status de ativação e identificar novas células estromais de linfonodos. Dependendo do tipo de análise de células do estroma, o protocolo de ligação ou Fletcher protocolo pode ser mais adequado. No processo descrito, de uma digestão enzimática ligeiramente mais curto é combinado com a desagregação mecânica automatizado para minimizar a degradação da superfície marcador linfáticos viável células estromais nó. Este procedimento permite que o isolamento altamente reprodutível edistinção de nódulos linfáticos de populações de células do estroma com uma baixa variabilidade e de mais do que 95% de viabilidade. As células do estroma de nódulos linfáticos isolados de fresco pode ser usado directamente para a expressão do marcador de superfície, a análise de proteínas, e estudos de transcrição, bem como o estabelecimento de linhas de células estromais de realizar os ensaios funcionais in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
O estudo das células do estroma dos nódulos linfáticos recentemente tornou-se um foco de investigação devido ao desenvolvimento de dois protocolos de digestão publicados 6,13. Ambos os protocolos são adequados para obter único nó de linfa de células estromais, mas diferem na utilização de enzimas de digestão e tempo de digestão. Uma vez que as células estromais e seus marcadores de superfície são sensíveis à digestão enzimática e tensão mecânica, um protocolo optimizado é necessária. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Sanjiv Luther and colleagues for helpful discussions in establishing the current lymph node digestion protocol. This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R.
Materials
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | Final concentration 2% | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | Final concentration 1.2 mM |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | use at 3.5 mg/ml |
| DNAse I | Roche | 11284932001 | use at 40 µg/ml |
| stiring magnets | FAUST | 5 mm long-2 mm ø | |
| Polystyren Round-Bottom Tubes 5ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| Magnetic stirrer with heating funktion | IKA-RCT-standard | 9720250 | |
| Petridishes 100 mm, sterile | TPP | 6223201 | |
| 25G needles | Terumo | ||
| anti mouse CD45 Ab | Biolegend | Clone 30-F11 | |
| anti mouse CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| anti mouse Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| anti mouse CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel |
Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 µl max. volume |
| anti mouse CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| anti mouse CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| anti mouse CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| anti mouse I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| anti mouse CD274 (PD-L1) | Biolegend | Clone 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit | Invitrogen | L10119 |
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