Summary

Экс Vivo Препараты неповрежденной вомероназального органа и аксессуаров обонятельная луковица

Published: August 04, 2014
doi:

Summary

Мышь аксессуар обонятельная луковица (АОВ) было трудно изучать в контексте сенсорной кодирования. Здесь мы демонстрируем рассечение, который производит Экс Vivo препарат, в котором AOB нейроны остаются функционально связан с их периферийных входов, содействия научным исследованиям в обработке информации феромонов мыши и kairomones.

Abstract

Мышь аксессуар обонятельная система (АОС) является специализированным сенсорная тропа для обнаружения энергонезависимые социальные запахи, феромоны и kairomones. Первый нейронной цепи в пути AOS, называется аксессуар обонятельная луковица (АОВ), играет важную роль в установлении секс-типичный поведения, такие как территориальной агрессии и спаривания. Этот небольшой (<1 мм 3) схема обладает способностью различать уникальные поведенческие состояния, такие как секс, процедить, и стресс от хемосенсорных киев в выделениями и экскрементами из сородичей. В то время как компактный организация этой системы представляет уникальные возможности для записи с большими участками цепи одновременно, исследование сенсорной обработки в АОБ остается сложной, во многом благодаря его экспериментально невыгодное расположение в мозгу. Здесь мы демонстрируем многоступенчатую рассечение, которое удаляет нетронутыми AOB в пределах одного полушария переднего черепа мыши, оставляя подключенияионы в обеих периферической вомероназальных сенсорных нейронов (VSNs) и местного нейронной цепи нетронутыми. Процедура предоставляет поверхность AOB направить визуальный осмотр, облегчая электрофизиологических и оптические записи из элементов АОБ цепи в отсутствие анестетиков. После вставки тонкий канюли в вомероназального органа (ВНО), в котором находится VSNs, можно непосредственно подвергать периферию к социальным запахов и феромонов время записи вниз по течению активность в АОБ. Эта процедура позволяет контролируемых расследований AOS обработки информации, которые могут пролить свет на механизмы, связывающие феромона рисков в случае изменения поведения.

Introduction

Сенсорная обработка в мозге млекопитающих обычно занимает несколько взаимно соединенных-нейрональные цепи, каждая из которых извлекает особенности от сенсорного ввода. В сенсорных путей, рано обработки информации является жизненно важным для нормального восприятия и поведения. В принадлежностей обонятельной системы (AOS), аксессуар обонятельная луковица (АОВ) является основным нейронной цепи увязки сенсорную периферию для последующих структур, которые диктуют гормональный баланс 1,2, агрессию 3 и возбуждение 4. Таким образом, обработка информации в рамках этой схемы, тесно связана с изменениями в поведении животных.

Аксессуар обонятельная луковица находится у мышей и крыс в спинной / хвостовой / задней поверхности основного обонятельной луковице (MOB) под плотным, васкуляризации носовой пазухи. АОВ получает афферентный иннервации от аксонов периферических вомероназальных сенсорных нейронов (VSNs), которые находятся в вомероназального органа (ВНО), маленькийл слепой состава трубки в передней морды чуть выше мягкого неба. Эти аксоны пересекают тонкий лист перегородки ткани на медиальной границе носовые проходы. Несколько исследований исследовали AOB нервные реакции к источникам AOS запахов (например, мыши мочи) в естественных условиях с использованием анестезированных мышей 5-7 или свободно-исследуя животных 8. Героическая наркозом в естественных условиях исследования, участвующих (а) tracheotomies для обеспечения глубокого наркоза и предотвращения аспирации жидкости стимулов 5-7, (б) стимуляции симпатической шейного ганглия 6 или прямой катетеризации вомероназального органа 5,7 ввести энергонезависимые запахи и (с) краниотомии с или без лобных абляции лепестков, чтобы электрода продвижение в АОБ 6. Пробудитесь / себя исследования 8-10 участвующие хирургической имплантации микродисков. В целом, эти экспериментальные парадигмы являются мощным, но крайне сложно и часто требует анестезии.

<p claсс = "jove_content"> Интересно, несколько исследований пытался сохранить сенсорные структуры и вниз по течению нейронных цепей живых вне тела (экс естественных условиях) с некоторым успехом 11-15. Поскольку связи между ВНО и АОБ остаются на той же стороне, и потому, что по средней линии перегородки ткань может подвергаться воздействию кислородом superfusate в одном полушарии, мы стремились разработать такую ​​одного полушария Экс Vivo подход, чтобы изолировать эти структуры при сохранении их функциональную связь. Недавно мы преуспели в достижении этой цели 16. Этот препарат сохраняет обе VNO и АОВ в живых и функционально соединен, по крайней мере 4 – 6 ч, так как оба аксоны (вдоль средней линии мягкой ткани перегородки АОВ) и сравнительно мелкой <600 мкм особенности, которые доступны для орошали кислородом искусственную спинномозговую жидкость ( ACSF). Это ВНО-АОВ экс естественных подготовка позволяет введение контролируемой стимулы в ВНО через тонкий катетер, ипрямого визуального доступа к небольшой АОБ для целенаправленной размещения электродов и / или живой флуоресцентной микроскопии. Этот способ является предпочтительным, если кто-то желает изучать эти схемы в отсутствие анестезии. Поскольку такой подход разрывает центробежные связи, он не очень хорошо подходит для расследований центробежной модуляции функции АОБ. ВНО-АОВ экс естественных подготовка трудно учиться, но как только достигнут производит надежную платформу, на которой по расследованию организации цепи, обработки информации и нейронной пластичности в этой мощной сенсорной цепи.

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Юго-Западного институционального комитета UT уходу и использованию животных на, и были выбраны таким образом, чтобы свести к минимуму стресс, дискомфорт и боли, испытываемой экспериментальных животных. <p class="jov…

Representative Results

Достижение успеха с этим препаратом занимает обширную практику, и имеет несколько этапов, на которой он может потерпеть неудачу. Следует ожидать, требовать много попыток, прежде чем добиться успеха. Обычай рассечение камера необходима для успешного завершения этого протокола, и должн?…

Discussion

ВНО-АОВ экс естественных получение описано в данном протоколе является полезной альтернативой наркозом в естественных условиях 5-7 и острой живой срез 17 экспериментов функции АОБ. В отличие от острых опытах АОВ срезов, которые также подвергнуть элементы схемы для …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) и запуска средств UT Юго-Западного (JPM).

Materials

Straight Scissors Fine Science Tools 14002-14
Fine Scissors-Straight Fine Science Tools 14060-10
Fine Scissors-Curved Fine Science Tools 14061-10
Adson Forceps Fine Science Tools 11006-12
#3 Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
#11 Scalpel Blades Fisher Scientific 3120030
Straight Carbon Steel Razor Blades Fisher Scientific 12-640
35 mm Petri Dish Fisher Scientific 08-772-21
Dissection Chamber Custom  N/A See Fig. 1
Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm Custom  N/A
Dow Corning Silicon Vacuum grease Fisher Scientific 146355D
#5 Forceps, Student Fine Science Tools 91150-20
#5 Forceps, Biologie Tip Fine Science Tools 11295-10
#5 Forceps, Student Fine Science Tools 91150-20
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08
0.0045" Polyimide Tubing A-M Systems 823400
1/16" Male Luer Cole-Parmer EW-45505-00
1/16" Tubing Fisher Scientific 14-171-129
Two ton epoxy Grainger 5E157
ValveBank Pressurized Perfusion Kit AutoMate Scientific 09-16
ValveLink digital/manual controller AutoMate Scientific 01-18
NaCl Sigma-Aldrich various
KCl Sigma-Aldrich various
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich various
MgCl2 hexahydrate Sigma-Aldrich various
NaHCO3 Sigma-Aldrich various
NaH2PO4 Sigma-Aldrich various
myo-inositol Sigma-Aldrich various
Na-pyruvate Sigma-Aldrich various
Na-ascorbate Sigma-Aldrich various
HEPES buffer Sigma-Aldrich various
glucose Sigma-Aldrich various

References

  1. Bruce, H. M. An exteroceptive block to pregnancy in the mouse. Nature. 184, 105 (1959).
  2. Bellringer, J. F., Pratt, H. P., Keverne, E. B. Involvement of the vomeronasal organ and prolactin in pheromonal induction of delayed implantation in mice. J Reprod Fertil. 59, 223-228 (1980).
  3. Bean, N. J. Modulation of agonistic behavior by the dual olfactory system in male mice. Physiol Behav. 29, 433-437 (1982).
  4. Meredith, M. Vomeronasal organ removal before sexual experience impairs male hamster mating behavior. Physiol Behav. 36, 737-743 (1986).
  5. Hendrickson, R. C., Krauthamer, S., Essenberg, J. M., Holy, T. E. Inhibition shapes sex selectivity in the mouse accessory olfactory bulb. J Neurosci. 28, 12523-12534 (2008).
  6. Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2010).
  7. Tolokh, I. I., Fu, X., Holy, T. E. Reliable sex and strain discrimination in the mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 13903-13913 (2013).
  8. Luo, M., Fee, M. S., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the accessory olfactory bulb of behaving mice. Science. 299, 1196-1201 (2003).
  9. Binns, K. E., Brennan, P. A. Changes in electrophysiological activity in the accessory olfactory bulb and medial amygdala associated with mate recognition in mice. Eur J Neurosci. 21, 2529-2537 (2005).
  10. Leszkowicz, E., et al. Noradrenaline-induced enhancement of oscillatory local field potentials in the mouse accessory olfactory bulb does not depend on disinhibition of mitral cells. Eur J Neurosci. 35, 1433-1445 (2012).
  11. Ames, A., Gurian, B. S. Electrical Recordings from Isolated Mammalian Retina Mounted as a Membrane. Arch Ophthalmol. 70, 837-841 (1963).
  12. Flock, A. F., Strelioff, D. Studies on hair cells in isolated coils from the guinea pig cochlea. Hear Res. 15, 11-18 (1984).
  13. Woodbury, C. J., Ritter, A. M., Koerber, H. R. Central anatomy of individual rapidly adapting low-threshold mechanoreceptors innervating the ‘hairy’ skin of newborn mice: early maturation of hair follicle afferents. J Comp Neurol. 436, 304-323 (2001).
  14. Llinas, R., Muhlethaler, M. An electrophysiological study of the in vitro, perfused brain stem-cerebellum of adult guinea-pig. The Journal of physiology. 404, 215-240 (1988).
  15. Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
  16. Meeks, J. P., Holy, T. E. An ex vivo preparation of the intact mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. J Neurosci Methods. 177, 440-447 (2009).
  17. Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
  18. Kato, H. K., Chu, M. W., Isaacson, J. S., Komiyama, T. Dynamic sensory representations in the olfactory bulb: modulation by wakefulness and experience. 76, 962-975 (2012).
  19. Meeks, J. P., Arnson, H. A., Holy, T. E. Representation and transformation of sensory information in the mouse accessory olfactory system. Nature. 13, 723-730 (2010).

Play Video

Cite This Article
Doyle, W. I., Hammen, G. F., Meeks, J. P. Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb. J. Vis. Exp. (90), e51813, doi:10.3791/51813 (2014).

View Video