Um novo método de Drug Administration para Multiple peixe zebra (<em> Danio rerio</em>) Ea quantificação da Retirada

Summary

A novel method for reducing variability when exposing fish to drugs is explained. Fish exposed to various patterns of ethanol exposure were found to have altered anxiety levels during withdrawal in a light/dark scototaxic assay.

Abstract

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely netted and transported between home aquaria and dosing tanks. In order to enhance the ease of compound administration, a novel method for transferring fish between tanks for drug administration was developed. Inserts that are designed for spawning were used to transfer groups of fish into the drug solution, allowing accurate dosing of all fish in the group. This increases the precision and efficiency of dosing, which becomes very important in long schedules of repeated drug administration. We implemented this procedure for use in a study examining the behavior of zebrafish in the light/dark test after administering ethanol with differing 21 day schedules. In fish exposed to daily-moderate amounts of alcohol there was a significant difference in location preference after 2 days of withdrawal when compared to the control group. However, a significant difference in location preference in a group exposed to weekly-binge administration was not observed.

This protocol can be generalized for use with all types of compounds that are water-soluble and may be used in any situation when the behavior of fish during or after long schedules of drug administration is being examined. The light/dark test is also a valuable method of assessing withdrawal-induced changes in anxiety.

Introduction

O peixe-zebra (Danio rerio) é uma pequena espécie de teleósteos originárias da Índia que é um organismo modelo útil para ^um comportamental e médica ^2,3 pesquisa. Peixe-zebra também são vulgarmente usado nos testes de várias substâncias farmacológicas, a fim de caracterizar o seu impacto sobre o comportamento. Vários dosagens e horários de administração de medicamentos têm sido utilizados para investigar o comportamento do peixe-zebra, após a administração de compostos tais como estimulantes ^{4, 5} e ansiolíticos etanol ^6-8.

Nosso laboratório tem investigado os efeitos de diferentes horários de administração de etanol sobre a ansiedade de peixe-zebra e locomoção no claro / escuro de ensaio bem validado ^{9, 20,} também comumente referido como o ensaio scototaxic. Um novo método de administração de etanol foi desenvolvido para aumentar a eficiência de repetitivo, a administração diária ao longo de um longo período de tempo (21 dias) ⁶ </sacima>. Métodos utilizados anteriormente eram práticos, no entanto, buscou-se desenvolver um método que reduz de compensação, com seus custos de tempo associados, e permitiu simultânea administração do fármaco de interesse para um grande número de peixes, precisamente cronometrado. Na pesquisa utilizando tradicional etanol, peixe-zebra são compensados ​​e transferido de um tanque para outro contendo a mistura apropriada de etanol e água ^10-12. Enquanto este método é amplamente aceite, a compensação de peixe-zebra pode aumentar a variabilidade no tempo necessário para introduzir e remover o peixe a partir da solução da droga. Portanto, a exposição exacto para o composto de interesse pode variar durante o curso de uma experiência que envolve a administração repetida. Um método que reduz as fontes de decorrentes da variabilidade nos tempos de transporte de erro é, portanto, desejável. Com o nosso método, somos capazes de mover todos os peixes ao mesmo tempo, resultando em um tempo de dosagem idêntica em cada peixe. Após a exposição ao etanol (descrito aqui), peixe-zebra pode ser testado em qualquer númer de ensaios comportamentais, incluindo aqueles que avaliam a ansiedade. Dosagem grupos de peixes usando o novo método tem usos práticos além da capacidade de reproduzir com exatidão e padronizar a dosagem entre sujeitos e entre grupos de peixes. O advento de um novo software que permite o rastreamento de peixes múltiplos de uma só vez pode ver os pesquisadores utilizam nossos métodos para garantir a replicabilidade e precisão em seus experimentos. Considerando-se a utilização generalizada de peixe-zebra como um organismo modelo para neurociência comportamental, este método vai aumentar a eficiência e viabilidade em futuros estudos farmacológicos.

No presente paradigma, um esquema de dosagem repetida foi empregado que aproximadamente espelha horários de consumo humano. Os peixes foram distribuídos aleatoriamente para um dos três grupos: controle, diária moderada, ou semanal-compulsivos. O esquema de administração foi de 21 dias de duração, escolheu porque excedeu significativamente os tempos de exposição em estudos anteriores ^7. Peixes controle recebeu a zero alcohol, peixe diariamente moderada receberam 0,2% de álcool, uma vez por dia e, semanalmente, binge peixe recebeu 1,4% de álcool, uma vez por semana. A tarefa de luz / escuro foi usado para avaliar a ansiedade após 2 dias de abstinência. Este é um teste relativamente simples de administrar, que utiliza uma arena rectangular em que as paredes de um lado, são de cor branca e no outro lado são escuros ^9. Peixe-zebra adulto robustamente preferem o lado negro da arena em condições de controle ^6,9,13. O aumento da ansiedade é operacionalmente definido como significativamente mais tempo gasto na zona escura, e diminuiu a ansiedade pode ser assumida quando o peixe passa relativamente mais tempo gasto na zona de luz. Com o software de rastreamento de movimento, outras variáveis ​​informativos também podem ser quantificados, incluindo velocidade média, a imobilidade, serpenteando, e zona de transição ^14.

O método de dosagem desenvolvido no nosso laboratório pode aplicar-se a qualquer pesquisa em que os compostos solúveis em água são administrados a um ou mais zebrafish. Muitos outros agentes farmacológicos que podem beneficiar desta metodologia estão sendo testadas em peixes-zebra. Comumente os compostos testados incluem a nicotina, clordiazepóxido, buspirona, e escopolamina, que são dissolvidos de um modo semelhante ao etanol; misturando a quantidade apropriada do produto químico em água. Portanto, o escopo geral deste procedimento é muito mais ampla e não limitada ao etanol. Além disso, após a dosagem com medicamentos para vários dias, a tarefa de luz / escuro é apenas um dos muitos testes comportamentais que podem ser empregadas. Após a administração de drogas ou durante a abstinência, outros ensaios populares que podem ser utilizados incluem o teste de mergulho novo tanque de ¹⁵ e testes de comportamento social, tais como empolamento ^16. O procedimento a seguir irá delinear um método eficiente de repetidamente transferir grupos de peixes ou peixes individuais em soluções que contêm um composto farmacológico de interesse. Além disso, o processo de teste de ansiedade com o teste de luz / escuroem grupos de peixe que se encontram em retirada depois de ser exposto a longas listas da administração do álcool irá ser descrito.

Protocol

Todos os procedimentos e testes comportamentais foram aprovadas pelo Conselho de Ética em Pesquisa Animal da Universidade MacEwan sob o protocolo número 06-11-12, que está em conformidade com o Conselho Canadense para as diretrizes do Animal Care para o cuidado e uso de animais de experimentação. 1. Prepare Tanques Dosagem, soluções e esquema de administração Preparar um esquema de administração de tal modo que os animais são doseados no mesmo ambiente e durante o mesm…

Representative Results

Para manter a precisão e controlo em estudos farmacológicos com peixe-zebra é importante para o tempo de duração da administração de etanol de forma consistente e com precisão, tal como descrito acima. O nosso procedimento pode aumentar o rendimento e a facilidade do procedimento de dosagem. A administração de etanol no horário ou uma compulsão semanal ou diária moderada resultou em níveis de ansiedade alterados, medidos com o teste de claro / escuro, em comparação aos controles. Quando testados dois dia…

Discussion

Estudos anteriores envolvendo a administração da droga no peixe-zebra simplesmente invocada compensação peixes para transportá-los a partir de seu tanque de casa para a solução de drogas ^12,16. Rede nem sempre é consistente e frequentemente leva mais tempo do que o esperado, devido à resposta de fuga do peixe-zebra, que tem variabilidade individual significativa. Métodos de transferência tradicionais, embora úteis, pode ser melhorado através da diminuição da quantidade de tempo total dos peixes…

Materials

Three Shelf benchtop housing system	Aquatic Habitats	N/A	http://aquatichabitats.com/research-systems/z-hab-system/
1.5L Spawning tank w/400 micron baffle	Aquatic Habitats	N/A	http://aquatichabitats.com/consumables/tanks-lids-and-baffles/info/nursery-tank-and-baffles/
Pure Grain Ethanol	Luxco, INC	N/A	http://www.luxco.com/public/brands/brands.asp?brandid=21
Ethovision XT Motion tracking software	Noldus Information Technology		http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt
Pipette	Eppendorf Canada		http://www.eppendorf.ca/int/index.php?l=211&pb=e396f9e705e754a3&action=products&contentid=1&catalognode=9477.
Light/Dark Arena	Custom		Construct as per procedure description. 9.5cm wide, 9.5cm deep, 55cm long