Een nieuwe methode van de Drug aan Multiple zebravis (<em> Danio rerio</em>) En de kwantificering van Terugtrekking

Summary

A novel method for reducing variability when exposing fish to drugs is explained. Fish exposed to various patterns of ethanol exposure were found to have altered anxiety levels during withdrawal in a light/dark scototaxic assay.

Abstract

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely netted and transported between home aquaria and dosing tanks. In order to enhance the ease of compound administration, a novel method for transferring fish between tanks for drug administration was developed. Inserts that are designed for spawning were used to transfer groups of fish into the drug solution, allowing accurate dosing of all fish in the group. This increases the precision and efficiency of dosing, which becomes very important in long schedules of repeated drug administration. We implemented this procedure for use in a study examining the behavior of zebrafish in the light/dark test after administering ethanol with differing 21 day schedules. In fish exposed to daily-moderate amounts of alcohol there was a significant difference in location preference after 2 days of withdrawal when compared to the control group. However, a significant difference in location preference in a group exposed to weekly-binge administration was not observed.

This protocol can be generalized for use with all types of compounds that are water-soluble and may be used in any situation when the behavior of fish during or after long schedules of drug administration is being examined. The light/dark test is also a valuable method of assessing withdrawal-induced changes in anxiety.

Introduction

De zebravis (Danio rerio) is een klein teleost soorten van oorsprong uit India, dat is een bruikbaar model organisme voor gedragsverandering ¹ en medisch onderzoek ^2,3. Zebravis worden ook vaak gebruikt bij het testen van verschillende farmacologische stoffen om hun impact op het gedrag karakteriseren. Diverse doseringen en schema van toediening zijn gebruikt om het gedrag van de zebravis na de toediening van verbindingen zoals stimulantia ^4, anxiolytica ⁵ en ethanol ^6-8 onderzoeken.

Ons laboratorium heeft het effect van verschillende schema ethanol toediening op zebravis angst en beweging in de goed gevalideerde licht / donker assay ^{9, 20,} ook bekend als de scototaxic assay onderzocht. Een nieuwe wijze van toediening ethanol werd ontwikkeld om de efficiëntie voor herhaalde dagelijkse toediening toenemen gedurende een lange periode (21 dagen) ⁶ </sup>. Eerder gebruikte werkwijzen waren praktisch echter zochten we een methode verrekening verminderd met bijbehorende tijdskosten ontwikkelen, en men tegelijkertijd nauwkeurig tijdgestuurde toediening van het geneesmiddel van belang grote aantallen vissen. In traditioneel onderzoek met behulp van ethanol, worden zebravis gesaldeerd en overgebracht van de ene naar de andere tank met de juiste mengsel van ethanol en water ^10-12. Hoewel deze methode is algemeen aanvaard, kan saldering zebravis de variabiliteit in de tijd genomen om te introduceren en te verwijderen van de vis uit de drug oplossing te verhogen. Daarom kan de exacte blootstelling aan de verbinding van belang variëren in de loop van een experiment met herhaalde toediening. Een methode die bronnen van fouten als gevolg van de variabiliteit in het vervoer tijden reduceert is dus wenselijk. Met onze methode kunnen we alle vissen tegelijk bewegen, waardoor identieke doseertijd per vis. Na blootstelling aan ethanol (hier beschreven) kunnen zebravissen worden getest in elke number gedrags- testen, waaronder die angst beoordelen. Doseren groepen van vis met behulp van de nieuwe methode heeft praktische toepassingen buiten het vermogen om nauwkeurig te repliceren en te standaardiseren dosering tussen onderwerpen en over groepen van vis. De komst van nieuwe software die het mogelijk maakt voor het volgen van meerdere vissen in een keer kan zien onderzoekers maken gebruik van onze methoden om herhaalbaarheid en nauwkeurigheid in hun experimenten. Gezien het wijdverbreide gebruik van zebravis als modelorganisme voor Behavioral Neuroscience, zal deze methode de efficiëntie en bruikbaarheid in de toekomst farmacologische studies te verhogen.

In het huidige paradigma, werd een herhaalde doseringsschema gebruikt die ongeveer weerspiegelt de menselijke drinken schema. Vissen werden willekeurig toegewezen aan één van drie groepen: controle, dagelijkse matige, of wekelijkse-binge. Het doseringsschema was 21 dagen duurden gekozen omdat het aanzienlijk belichtingstijden in eerdere studies ⁷ overschreden. Controlevissen ontvangen nul alcohol, ontving dagelijks matige vis 0,2% alcohol een keer per dag, en wekelijks binge-vis ontvingen 1,4% alcohol een keer per week. Het licht / donker taak werd gebruikt om angst te beoordelen na 2 dagen van terugtrekking. Dit is een relatief eenvoudige test te beheren met een rechthoekige arena waarin de wanden enerzijds zijn wit en anderzijds donker ⁹ gebruikt. Volwassen zebravissen robuust voorkeur aan de donkere kant van de arena onder controle condities ^6,9,13. Toegenomen angst is operationeel gedefinieerd als aanzienlijk meer tijd in de donkere zone en verminderde angst kan worden aangenomen wanneer de vis besteedt relatief meer tijd in de lichte zone. Met motion-tracking software, kunnen andere informatieve variabelen ook worden gekwantificeerd, zoals gemiddelde snelheid, immobiliteit, meanderende, en zone overgangen ^14.

De dosering methode ontwikkeld in ons laboratorium kan worden toegepast op elk onderzoek waarbij in water oplosbare verbindingen worden toegediend aan één of meer zebrafish. Veel andere farmacologische middelen die kunnen profiteren van deze methodiek worden momenteel getest in de zebravis. Gewoonlijk geteste verbindingen omvatten nicotine, chloordiazepoxide, buspiron en scopolamine, die zijn opgelost in een soortgelijke wijze ethanol; door mengen van de juiste hoeveelheid van de chemische stof in water. Daarom is het algemene toepassingsgebied van deze procedure is veel breder en niet beperkt tot ethanol. Bovendien na toediening van geneesmiddelen voor meerdere dagen, de licht / donker taak is slechts één van vele gedragstesten die kunnen worden toegepast. Na toediening van het geneesmiddel of tijdens de terugtrekking, andere populaire assays die kunnen worden gebruikt zijn onder andere de roman tank duiken-test ¹⁵ en tests van sociaal gedrag zoals shoaling ^16. De volgende procedure zal een efficiënte methode van herhaaldelijk overbrengen groepen van vis of van individuele vissen in oplossingen die een farmacologische verbinding van belang te schetsen. Bovendien, het proces van het testen van angst met de licht / donker-testin groepen van vis die in intrekken na blootstelling aan lange lijsten van alcohol toediening worden beschreven.

Protocol

Alle procedures en gedragsmatige testen werden goedgekeurd door MacEwan University's Animal Research Ethics Board onder protocol nummer 06-11-12, dat is in overeenstemming met de Canadese Raad voor Animal Care's richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. 1. Bereid Doseren Tanks, Solutions, en het toedieningsschema Bereid een toedieningsschema dat de dieren worden toegediend in dezelfde omgeving en gedurende dezelfde tijd van de dag aan een verwart tijd …

Representative Results

Om de nauwkeurigheid en controle farmacologische studies zebravis is het belangrijk om tijd de duur van ethanol toediening consistent en nauwkeurig beschreven behouden. Onze procedure kan het gemak en de doorvoer van de dosering procedure te verhogen. De toediening van ethanol op een wekelijkse-binge of dagelijks matige schema resulteerde in gewijzigde angst niveaus, gemeten met de licht / donker-test, in vergelijking met controles. Wanneer onderzocht twee dagen na de laatste toediening zebravis in de controlegroep (die…

Discussion

Vorige studies met toediening van het geneesmiddel in de zebravis hebben gewoon vertrouwd op saldering vis om ze te vervoeren van hun huis tank in de drug oplossing ^12,16. Saldering is niet altijd consistent en duurt vaak langer dan verwacht als gevolg van de ontsnapping respons van de zebravis, die aanzienlijke individuele variatie heeft. Traditionele overdrachtsmethoden, hoewel nuttig, kan worden verbeterd door de hoeveelheid van de totale tijd doorbrengen vis buiten water, evenals het verminderen van de ho…

Materials

Three Shelf benchtop housing system	Aquatic Habitats	N/A	http://aquatichabitats.com/research-systems/z-hab-system/
1.5L Spawning tank w/400 micron baffle	Aquatic Habitats	N/A	http://aquatichabitats.com/consumables/tanks-lids-and-baffles/info/nursery-tank-and-baffles/
Pure Grain Ethanol	Luxco, INC	N/A	http://www.luxco.com/public/brands/brands.asp?brandid=21
Ethovision XT Motion tracking software	Noldus Information Technology		http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt
Pipette	Eppendorf Canada		http://www.eppendorf.ca/int/index.php?l=211&pb=e396f9e705e754a3&action=products&contentid=1&catalognode=9477.
Light/Dark Arena	Custom		Construct as per procedure description. 9.5cm wide, 9.5cm deep, 55cm long