涙腺(LG)は、ビジョンと眼の健康を維持するために必要な涙の水性成分を生成し、分岐器官である。ここでは、LG電子の開発に関与するシグナル伝達経路を解読するネズミLG郭清およびex vivo培養技術を説明しています。
涙腺(LG)は、角膜の構造と機能、視力に不可欠な透明な組織を維持するために必要な水性涙を分泌する。 5ダクト – 人間では、単一のLGは3を通して眼表面に涙を配信するそれぞれの目の横端上記の軌道上に存在します。マウスは、主要な眼の腺の3ペアを持って、そのほとんどが研究され、耳に眼窩外涙腺(LG)に位置し、前方および腹です。他の腺の器官と同様に、LG電子は、凝縮された間葉内の単一の上皮芽が分泌腺房とダクトの複雑な相互接続ネットワークを形成するために、つぼみとダクト形成の複数のラウンドを受けるものでは上皮の分岐形態形成のプロセスを経て開発しています。この精巧なプロセスは、よくそのような膵臓および唾液腺などの多くの他の上皮の器官で文書化されています。しかし、LGはあまり検討されていると形態形成を制御するメカニズムは不完全に下です立っていた。我々は、このアンダー表現モデル系としては、見つけ解剖とLGを培養することに関連する困難の結果であることを疑う。したがって、ここでは解剖収穫胚および出生後のLGのための技術や組織のex vivo培養のための方法が記載されている。
涙腺(LG)は、視力や健康、保守、および眼表面の細胞の保護のために重要なの水性涙液分泌を担当しています。眼の刺激、光感受性によって特徴づけられるとビジョン1を減少させ、水性欠乏ドライアイ病、:最も一般的な衰弱性眼疾患の一つでLGの機能不全をもたらす。眼表面上に5排泄ダクト預金涙 – 人間ではLGが3目の側端より上の軌道に存在します。マウスは、主要な眼の腺の3ペアを持って、そのほとんどが研究され、単一の排泄ダクトを経由して、目に涙を浮かべて旅行する耳(眼窩)へ涙腺(LG)に位置し、前方および腹です。他の腺の器官と同様に、LG電子は、凝縮された間葉内の単一の上皮芽が複数の芽のラウンドとするために、ダクトの形成を受けている上皮の分岐形態形成のプロセスを経て開発分泌腺房とダクトの複雑な相互接続されたネットワーク( 図1)2メートル。開発中は上皮は血管新生になるだけでなく、頻繁に翼口蓋神経節の副交感神経によって上頸神経節3から交感神経によってより少ない程度に神経支配。これらの細胞の種類すなわち神経細胞、上皮細胞、内皮細胞および間葉細胞のそれぞれとの間の相互作用は、成体組織の機能と維持に不可欠である。しかし、セル間タイプの通信は、これらのプロセスをガイドする方法と同様にLGの発達と再生を調整する基礎となる分子機構は依然として不明である。
胚のエクスビボで培養技術の出現は、複数の分岐臓器4の発達と再生経路の同定を可能にした。 ex vivoで培養する研究者を(私に臓器を操作する機能を提供しますリアルタイムでの臓器の発達および細胞 – 細胞相互作用を特徴付けるために、遺伝的または化学的)規定された条件下で同様に機械的、。マウスの眼窩LGがこの技術に非常に適していると最近の研究では、その開発2,5を規制するシグナル伝達系を定義しました。しかし、LG電子の開発と再生を支える分子手がかりを理解する必要にもかかわらず、それは現在、原因臓器を単離する技術的困難に思わ代役のまま。本稿では、分離して発生プログラムを定義するために、胚ネズミLG のex vivo文化を実行する方法について説明します。
文化への汎用性とex vivoで 、LGを操作は、その開発を研究するための重要な利点を提供します。これは、研究者の仮説と、神経、内皮およびmesencyhmal細胞は器官を形成するように相互作用する方法を、上皮評価することができる多数の摂動をテストすることができる速度を含む。このモデルを利用する場合しかし、警告の数が存在する。まず、その分離によって腺は、それらが神経や血?…
The authors have nothing to disclose.
著者は、UCSFリソース割当プログラムにより提供される資金調達を承認したいと思います。
Name | Catalog #. | Company | Comments/Description |
DMEM/F12 without HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
Albumin solution from bovine serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
Paraformaldehyde 16% Solution | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Diluted to 4% in 1X PBS |
Phosphate Buffered Saline 10X | BP665-1 | Fisher Scientific | |
Phosphate Buffered Saline 1X | Prepared from 10X stock | ||
holo-Transferrin bovine | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL. |
L- Ascorbic acid (Vitamin C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL. |
BioLite 100mm Tissue Culture Treated Dishes | 130182 | Thermo Scientific | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
Stereo Microscope with substage iluminator | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
Substage Illuminator Base for Stereo Microscope | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
Falcon 35mm Tissue Culture Treated Dishes | 353001 | Corning | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
50mm uncoated glass bottom dishes | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
Widefield fluorescence microscope | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
Confocal Microscope | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
Ideal for harvesting glands from embryos | |||
SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideal for harvesting glands from embryos |
Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit | AM1931 | Life Technologies | |
Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12 |
Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 um pre size, 13mm | 110405 | Whatman | |
Timed-pregnant Pax6-Cre,GFP mice | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optional mice for learning how to locate the LG. |