Saggio di crescita a base Reporter, per l'analisi sistematica di proteine degradazione
Summary
Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.
Abstract
Proteina degradazione da parte del sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) è un importante meccanismo di regolazione per le proteine omeostasi in tutti gli eucarioti. L'approccio standard per la determinazione intracellulare degradazione delle proteine si basa su test biochimici per seguire la cinetica di declino proteine. Tali metodi sono spesso laboriosa e che richiede tempo e quindi non suscettibili di esperimenti volti a valutare diversi supporti e condizioni di degrado. In alternativa, sono stati sviluppati saggi di crescita a base di cellule, che sono, nel loro formato convenzionale, saggi end-point che non può determinare quantitativamente relativi cambiamenti nei livelli di proteina.
Qui si descrive un metodo che determina fedelmente le variazioni dei tassi di degradazione delle proteine da loro accoppiamento con lievito cinetica di crescita delle cellule. Il metodo si basa su un sistema di selezione stabilito dove uracile Auxotrofia di URA3 -deleted cellule di lievito viene salvato da una proteina reporter esogena espressa, Composto da una fusione tra il gene URA3 essenziale e determinante degradazione (degron). La proteina reporter è progettato in modo che la sua velocità di sintesi è costante mentre la sua velocità di degradazione è determinata dal degron. Come la crescita delle cellule in terreno uracile-carente è proporzionale ai relativi livelli di URA3, cinetica di crescita sono del tutto dipendenti dalla degradazione delle proteine giornalista.
Questo metodo di misura con precisione variazioni di intracellulari cinetica di degradazione delle proteine. E 'stato applicato a: (a) valutare il contributo relativo dei fattori-ubiquitina coniugare note alla proteolisi (b) E2 coniugare enzima struttura-funzione analizza (c) Identificazione e caratterizzazione di nuovi degrons. L'applicazione del sistema basato URA3 degron- trascende campo degradazione delle proteine, come può anche essere adattato ai cambiamenti di monitoraggio dei livelli di proteine associate con funzioni di altre vie cellulari.
Introduction
Il sistema di degradazione ubiquitina-proteasoma è una grande macchina di regolamentazione, che è stata implicata nel mantenimento dell'omeostasi delle proteine in tutti gli eucarioti. Il gruppo di continuità coniuga inizialmente più molecole di ubiquitina ad una proteina bersaglio dopo che la proteina poli-ubiquitina-tag è degradata dal proteasoma 26S. Nella maggior parte dei casi, il fattore limitante per l'ubiquitina mediata degradazione è ubiquitinazione substrato, mediato da E2 coniugando enzimi e E3 legatura enzimi (E3 ligasi) 1. Di conseguenza, la stabilità intracellulare di specifiche proteine riflette la loro suscettibilità alla ubiquitina-coniugazione e l'attività dei loro enzimi ubiquitinazione affini.
Ligasi E3 sono i componenti di riconoscimento del substrato principali del gruppo di continuità. Come tali, questi enzimi riconoscono degrons nei loro substrati che sono o assenti o non esposto nelle loro controparti stabili 2. Per esempio, molti regolatori del ciclo cellulare must essere sintetizzato e degradato in maniera temporalmente specifico al fine di mantenere la progressione del ciclo cellulare in ordine. La degradazione di queste proteine è spesso controllata dalla fosforilazione, mediata da cellule di segnalazione chinasi regolate 3,4. D'altra parte, le proteine aberrante piegati sono riconosciuti attraverso degrons criptici. Si tratta di regioni che normalmente sono nascosti nella struttura nativa e sono esposti su struttura perturbazione. Tali degrons comprendono domini idrofobici 5-7 e segmenti intrinsecamente disordinati 8.
Dalla scoperta fondamentale della ubiquitina-sistema di degradazione delle proteine e la caratterizzazione dei suoi fondamentali nei lisati di reticolociti 9, genetica del lievito è stato determinante nella scoperta molti dei componenti del sistema ubiquitina 10. Il successo di lievito come organismo modello per l'analisi sistematica della degradazione proteica dal gruppo di continuità è dovuto principalmente al fatto che il gruppo di continuità è altoly conservato in tutti gli eucarioti 4, unita alla loro riconducibilità come sistema sperimentale. In effetti, i sistemi a base di lievito sono comunemente impiegati per decifrare i meccanismi di azione della macchina ubiquitinazione.
Studiando proteina degradazione mediante biochimici solito richiede la preparazione di estratti cellulari. Mentre le proteine cellulari animali possono essere estratti in condizioni relativamente blande che conservano le interazioni e la funzione della proteina, la presenza di una parete cellulare robusto in lievito 11 richiede condizioni perturbazione considerevolmente più dure che possono influenzare il recupero delle proteine. In effetti, diverse modalità di rottura delle cellule di lievito variano notevolmente nella loro capacità di recuperare proteine intatte in quantità che rappresentano correttamente la loro abbondanza relativa cellulare. Ulteriore inesattezza è inerente i diversi metodi utilizzati per la determinazione del tasso di degradazione di proteine specifiche: a base di etichettatura relativa ad esperimenti metabolici "pulse-chase" seguita da immunoprecipitation, per isolare proteine specifiche 12, spesso non è strettamente quantitativo. Così, quando la degradazione delle proteine viene confrontato con questo metodo, estrema cautela deve essere esercitata nell'interpretazione dei risultati. Per ovviare a questo inconveniente, un cicloesimmide alternativa (CHX) test inseguimento può essere impiegato 12. In questo saggio, l'inibitore di traduzione è aggiunta a colture cellulari e cambiamenti temporali nei livelli di proteine allo steady-state vengono successivamente monitorati. Tuttavia, l'utilizzo di CHX è limitato alle proteine con emivite relativamente brevi (<90 min), l'inibizione a lungo termine della sintesi proteica è citotossico. In particolare, entrambi i saggi suddette richiedono l'uso di anticorpi specifici per proteine che non sono sempre disponibili.
Per superare queste limitazioni tecniche, i ricercatori hanno sviluppato diversi approcci che non richiedono l'estrazione delle cellule e la manipolazione diretta di proteine. Un approccio si basa sulla creazione di yea auxotrophicceppi st, ottenuti per delezione di geni codificanti enzimi metabolici essenziali. Tali geni includono HIS3, LEU2, LYS2 e TRP1, codifica per gli enzimi necessari per la biosintesi degli aminoacidi, così come URA3 che codifica OMP decarbossilasi (URA3), un enzima essenziale della pirimidina ribonucleotide biosintesi. URA3 è stato ampiamente utilizzato in studi di degradazione proteica. In questi test, espressione costitutiva di URA3 salva la crescita delle cellule URA3 in uracile con deficit medio 13. Di conseguenza, destabilizzare URA3 attraverso la fusione di un degron può ridurre la crescita delle cellule su terreno minimo privo di uracile. Questo metodo è stato utilizzato in diversi studi di degradazione delle proteine, compresa l'individuazione di degrado determinanti 5, E3 ligasi 14 e ubiquitinazione ausiliario fattori 15 e la scoperta di nuovi UPS degrons 16. Tutti questi metodi impiegati crescita cellulare su piastre di agar come test di lettura. Tuttavia, tche il criterio di crescita (crescita positivo / negativo), mentre la robusta ed efficiente, è per lo più qualitativa e non fornisce informazioni quantitative che è importante per valutare la potenza di un degron o il contributo relativo dei diversi fattori di degrado ausiliari.
Abbiamo quindi messo a punto e utilizzato vettori di lievito e metodi di screening che consente un'analisi sistematica e quantitativa di degradazione delle proteine da parte del URA3 -degron sistema di fusione. Il protocollo si basa su un saggio di facile impugnatura che misura la cinetica di crescita in coltura liquida in condizioni selettive (Gils) e sulla generazione delle curve di crescita standard. Cinetica di crescita del lievito sono caratterizzate da tre fasi principali – il ritardo, l'esponenziale (log) e la fase stazionaria. Calcolo della cinetica di replicazione del lievito durante la fase log in condizioni selettive, che è determinata dai livelli di espressione della URA3-degron, fornisce un imparziale misurazione quantitativa of degradazione delle proteine. Questo metodo può essere applicato a misurare e comparare i tassi di degradazione di substrati multipli UPS contemporaneamente in più ceppi e in diverse condizioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui si descrive un saggio basato sulla crescita delle cellule per la determinazione del tasso di degradazione delle proteine relativi, definiti "la cinetica di crescita in coltura liquida in condizioni selettiva" (Gils). Il test Gils ha diversi vantaggi: è semplice da configurare, l'acquisizione dei dati e l'analisi è semplice ed è estremamente modulare. Di conseguenza, Gils può essere applicata contemporaneamente a più campioni in un facile da usare formato di piastra multi-bene che può es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma – Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma – Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma – Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma – Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96 well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma – Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used | |
| MDTcalc | Experimental software |
References
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
- Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
- Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
- Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
- Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
- Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. 遗传学. 192, 319-360 (2012).
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
- Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
- Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. 遗传学. 117, 5-12 (1987).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
- Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
- Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, (1991).
- Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
- Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
- Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
- Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
- Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).
