Lesão Balloon Vascular e Administração Intraluminal em Rat Carótida

Summary

Este protocolo utiliza um cateter balão para causar uma lesão intraluminal na artéria carótida de rato e, doravante, provocar hiperplasia neointimal. Este é um modelo bem estabelecido para o estudo dos mecanismos de remodelação vascular em resposta a lesão. É também amplamente utilizada para determinar a validade de potenciais abordagens terapêuticas.

Abstract

O modelo de lesão por balão da artéria carótida em ratos tem sido bem estabelecida há mais de duas décadas. Mantém-se um método importante para estudar os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na desdiferenciação do músculo liso vascular, a formação da neoíntima e remodelação vascular. Ratos machos Sprague-Dawley são os animais mais utilizados para este modelo. Ratas não são preferidos como hormônios femininos protegem contra doenças vasculares e, assim, apresentar uma variação para este procedimento. A carótida esquerda é tipicamente feridos com o carótida direita que serve como um controlo negativo. Lesão carótida esquerda é causada pelo balão insuflado que desnuda o endotélio e distender s parede do vaso. Após lesão, potenciais estratégias terapêuticas tais como a utilização de compostos farmacológicos e qualquer gene ou shRNA transferência pode ser avaliada. Tipicamente para gene ou transferência shRNA, a seção de feridos do lúmen do vaso é transduced localmente por 30 min com vIRAL partículas que codificam uma proteína ou shRNA ou para a entrega e expressão na parede do vaso lesionado. Espessamento neointimal que representa as células musculares lisas vasculares proliferativas normalmente picos a 2 semanas após a lesão. Os vasos são principalmente colhidas neste ponto de tempo para análise celular e molecular de vias de sinalização celular, bem como a expressão do gene e proteína. As embarcações também podem ser colhidas a pontos de tempo anteriores para determinar o início da expressão e / ou activação de uma proteína ou via específica, de acordo com os objectivos pretendidos experimentais. Os navios podem ser caracterizadas e avaliadas por meio da coloração histológica, imunohistoquímica, ensaios de proteína / mRNA, e ensaios de atividade. A artéria carótida direita intacto do mesmo animal é um controle interno ideal. Mudanças induzidas pelo prejuízo, em parâmetros moleculares e celulares pode ser avaliada comparando a artéria ferido à artéria controle direito interno. Da mesma forma, as modalidades terapêuticas pode ser avaliada comparando a firad e tratado artéria para o controle lesionado só artéria.

Introduction

Os cateteres de balão são dispositivos médicos utilizados no procedimento da angioplastia, com a finalidade de alargamento local obstruído (s) de ateroma ou trombo num vaso sanguíneo. Os lúmen do vaso estreitadas é forçado a abrir pelo balão inflado e fornecimento de sangue seria restaurada sequencialmente para aliviar os sintomas de isquemia a jusante, tais como angina, infarto do miocárdio e dor na perna. No entanto, o grande sucesso da angioplastia foi diminuída por complicações pós-operatórias, tais como resultados de força causando barotrauma vascular (lesão por balão), nomeadamente a remodelação da parede do vaso e, em muitos casos re-estreitamento da luz do vaso (reestenose) ^1.

Uma série de modelos animais têm sido desenvolvidas imitando o procedimento de angioplastia para ajudar os investigadores a compreender os mecanismos subjacentes a embarcação remodelação parede relacionados com o balão-lesão ^2. Entre todas as espécies de animais utilizados para a modelagem, o rato é o mais utilizado. Compared a coelhos, cães e porcos, as vantagens de os ratos são seu baixo custo, sua relativa facilidade de uso e o conhecimento atual da fisiologia rato. Embora os ratos têm uma vantagem adicional em uma ampla gama de estirpes geneticamente manipuladas, o navio ratinhos é muito pequeno para inserir um cateter balão. Ao longo das últimas três décadas, os ratos experimentais têm permitido aos pesquisadores obter uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares e celulares que sustentam a formação da neoíntima e remodelação vascular ^3-6. Além da lesão do balão, o remodelamento vascular também estão envolvidos na maioria das doenças vasculares importantes, como a aterosclerose ^7,8, hipertensão ⁹ e ^{10 de} aneurisma. Assim, o conhecimento adquirido através do modelo de lesão balão é, em geral, benéfica para estudos globais da doença parede vascular.

O objectivo geral do modelo de lesão por balão de rato não é apenas de compreender ainda as doenças vasculares, mas também para testar a potência de novos agentes parao controle da doença ^11,12. Tratamento medicamentoso clínico atual para reestenose é aplicado por stents farmacológicos efectuadas através do lúmen do vaso logo após a angioplastia. Em modelos animais, uma forma eficiente ainda mais econômica para novos testes agente é um método de perfusão intraluminal locais bem desenvolvida. Os agentes candidatos que foram testados através deste método incluem drogas de moléculas pequenas ^13,14, citocinas ou factores de crescimento ^15,16, agentes de manipulação de genes (clones de cDNA, siRNA, etc.), ^17-20, e novas formulações farmacêuticas ^21,22.

Até agora, o modelo de lesão balão rato continua sendo um dos modelos mais úteis para o estudo de doenças / distúrbios vasculares. É o passo fundamental da bancada de cabeceira, geralmente como o primeiro passo, no sentido de in vitro para in vivo, mas não deve ser o último. O resultado de experiências com ratos precisa ser deliberado e ainda caracterizado antes tradução humanautilização clínica, devido à diferença de leitos vasculares e a anatomia do vaso, bem como as diferenças intrínsecas entre as espécies humana e de rato ^23-26. No entanto, ainda é uma ferramenta essencial na investigação médica translacional. Embora essa pesquisa utilizou a ser limitada pela falta de ratos geneticamente modificados, que deixou de ser um problema desde abordagens genômicas inéditas, como zinc-finger nucleases ^{27, 28} e TALENS CRISPR-Cas ²⁹ fizeram ratos knockout facilmente acessível.

Protocol

NOTA: O uso de animais para os seguintes experimentos tem sido revisado e aprovado pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC). 1. Procedimentos pré-operatórios Esterilizar instrumentos cirúrgicos antes de usar. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos 24 horas ou menos antes da cirurgia. Se várias cirurgias são realizadas no mesmo dia, esterilizar os instrumentos por um esterilizador talão seca entre cirurgias. Filtro-esteri…

Representative Results

Duas semanas após a lesão, artérias carótidas são colhidas, seccionados e sujeitos a análise morfológica. As artérias são cross-seccionados e corados com H & E (Figuras 1, 2B, C e 3). Da parede da artéria carótida de rato contém quatro camadas de lâmina elástica, que aparecem como linhas de rosa. A área entre a lâmina externa, lâmina elástica externa (EEL) e a lâmina mais interior, da lâmina elástica interna (IEL) é a camada de músculo liso meios (Figura 1). A…

Discussion

O rato da lesão do balão carótida foi bem descrito por Tulis em 2007 ^34. Tem sido exaustivamente discutido todos os detalhes deste procedimento pelo Dr. Tulis. Os leitores que estão interessados ​​em realizar este procedimento são altamente recomendados para ler protocolo Tulis '. No entanto, há uma coisa que não está concordando com o Dr. Tulis: Em vez de inflar o balão com soro fisiológico ou qualquer tipo de líquido, sugerimos para inflá-lo com o ar. De acordo com nossa experiência pessoal, inflando com l?…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fogarty balloon embolectomy catheters, 2 French	Edwards Lifesciences, Germany	120602F
Deltaphase Operating Board – Includes 2 Pads & 2 Insulators	Braintree Scientific, Inc.	39OP
LED light source	Fisher Scientific	12-563-501
Hartmann Mosquito Forceps 4” curved	Apiary Medical, Inc. San Diego, CA	gS 22.1670
Crile Retractor 4” double ended	Apiary Medical, Inc.	gS 34.1934
Other surgical instruments	Roboz Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg, MD
Peripheral Intravenous (I.V.) Cannula, 24G	BD	381312
Ketamine HCl, 100mg/mL, 10mL	Ketaset- Patterson Vet	07-803-6637
Xylazine (AnaSed),20mg/mL,20mL	Ketaset- Patterson Vet	07-808-1947
Buprenex, 0.3mg/1ml (5 Ampules/Box)	Ketaset- Patterson Vet	07-850-2280
Nair Baby Oil Hair Removal Lotion-9 oz	Amazon/Walmart/CVS	N/A
Inflation Device	Demax Medical	DID30
D300 3-way Stopcock	B.Braun Medical Inc.	4599543
Artificial Tears Ointment	Rugby Laboratories, Duluth, GA	N/A