Eldeki gelişimsel süreçleri on gün içinde bir zamansal degrade üzerinde çalışacak, çünkü embriyonik memeli Kokleanın Canlı görüntüleme zordur. Burada beş gün boyunca bir floresan raportör fare alınan embriyonik koklear eksplant doku görüntüleme sonra kültürleme ve için bir yöntem mevcut.
Burada canlı embriyonik fare koklear eksplantlannın uzun vadeli time-lapse görüntüleme için bir yöntem mevcut. Yaklaşık on gün boyunca memeli koklea gelirlerinin son derece düzenli, kompleks bir yapı oluşturmanın sorumlu gelişimsel programı. Bu süre boyunca gen ifadesindeki değişiklikler ve farmasötik veya genetik manipülasyona tepkilerini incelemek amacıyla, uzun dönemli görüntüleme gereklidir. Daha önce, canlı görüntüleme tipik olarak, standart bir mikroskop üzerinde bir nemlendirilmiş oda içinde Çıkarılan dokunun yaşayabilirliği ile sınırlandırılmıştır. Nem ve sıcaklık açısından Kültür büyümesi için gerekli ideal koşulları altında güçlüğü görüntüleme deneyleri uzunluğuna sınırları vermiştir. Değiştirilmiş bir doku kültürü inkübatör entegre bir mikroskop uzun vadeli-canlı görüntüleme için mükemmel bir ortam sağlar. Bu yöntemde biz embriyonik fare koklear eksplantlar kurmak nasıl ve zaman atlamalı IMAGI yapmak için bir inkübatör mikroskop nasıl kullanılacağını göstermektedirng 5 gün boyunca tipik embriyonik gün (E) 13 koklear çıkarılması ve Sox2, koklea prosensory hücrelerin bir göstergesi, davranışını incelemek için parlak bir alan ve floresan mikroskopi her ikisini de kullanarak.
Memeli salyangozunun bir çok sipariş karmaşık bir organdır. Fare, doğum sonrası erken aşamalarında otik gün E11 üzerinde vezikül ve gelişimsel programın tamamlanmasından itibaren ilkel iç kulağın ortaya çıkması arasında, hücre sinyal birden dalgaları ve gen ifadesi koordine değişiklikler gerçekleşir. Koklear kanalın doruk tabanından çalışan Corti duyusal epiteli, organ ya da tespit sesidir. Corti organı Kalkınma zarif gelişme sonunda, bu iç saç hücrelerinin tek bir satır oluşacaktır şekilde kontrol edilir, dış saç hücrelerinin üç sıra destek hücrelerin beş satır (sütun hücrelerin iki satır, üç serpiştirilmiş Deiters 'hücrelerin satır) 1. , Işitme kaybı oluşumu ve duyusal epithemlium 2 desenlendirme kesitler studye önemini heighlighting Bu kesin emir sonuçlarından sapma.
Embriyonik fare Coch in vitro kültür içindelea Corti organı gelişme mekanizmaları eğitim önemli bir araçtır. Bu teknik 1974 yılında kurulmuş ve son 40 yıldır, duyusal epitel belirtilen ve Corti organı 3 kurulduğu tarafından mekanizmaların birçok aydınlatmak için kullanılır olmuştur. Cochlea dinamik gelişim süreçleri ile karmaşık bir organdır; yedi gün 1 tezahür olarak bir manipülasyon olarak uzun sürebilir. E13 bir koklear eksplant kültürü için GSK, 3β inhibitörlerin eklenmesi, örneğin,, en uygun kuluçka süresi bileşiğinin güçlü bir etkisi altı gün 4 gözlemlemek.
Gelişmekte Kokleanın Canlı görüntüleme Corti organı morfoloji değişiklikleri soruşturma verir, gen ifadesi değişiklikleri, göç ve izleme çoğalan veya hücreleri ölüyor, ve gerçek-zamanlı ilaç ajanların sonuçlarının gözlem ve sinyalizasyon bozulması sağlar yollar. Şimdiye kadar, Kokleanın Canlı görüntülemeyeağırlıklı olarak kısa süreler 5-8 üzerinde Corti organı görüntü küçük alanlarda konfokal mikroskopi kullanılarak gerçekleştirilen, ancak bu tekniğin eksplant canlılığı nedeniyle sınırlamalar sahiptir. Yavaş gelişim süreçleri uzun süreli manipülasyon etkilerinin görüntülemede, görüntüleme ortamında çok önemlidir. Tipik bir konfokal canlı görüntüleme sistemi mikroskop oturur nemlendirilmiş bir plastik kutu kullanır. Isı ve nem gibi objektif veya ışık kaynağı olarak eklemli açıklıklar içinden ve microscope- çeşitli parçaları etrafında boşluklar aracılığıyla, erişim pencerelerden, mikroskop tablo uygun kuluçka kutusuna boşluklar kaçabilir. Bu fazla iki veya üç gün boyunca sağlıklı eksplantlarını korumak için optimal değildir.
Biz standart bir CO 2 inkübatör içinde mühürlü bir ters mikroskop yerine mikroskop etrafında inşa edilen bir inkübatör olarak 'inkübatör mikroskop' tanımlar. Bir inkübatör mikroskop exDeneyin ömrünü uzatmaktadır yerine, iki veya üç gün boyunca görüntüleme daha, örnekler iki haftaya kadar süre için görüntülü şekildedir. Bir inkübatör mikroskop kültürleri ve standart kontrollü koşullar eksplantasyona minimal rahatsızlık, hücre büyümesi ve farklılaşması için mükemmel bir ortam sağlar. Birden fazla gün içinde yer alan çalışmalarda inkübatörden çıkardıktan ve bir ters flüoresan mikroskop bunları taşıyarak günlük olarak görüntüleme örneklere başvurmak olağandır. Bu yaklaşım işe iken, inkübatör bulaşıkları kaldırma duyarlı gelişmekte olan doku üzerinde stres uğratan. Nedeniyle inkübatörden çıkarıldıktan için sıcaklık kültürleme orta ve dalgalanmalar asit değişiklikleri optimal gelişim ve sağlıksız dokuya neden olabilir. Aynı odak düzlemi ve her zaman noktasında aynı yönde aynı bölgeyi görüntüleme son derece zordur. Bir inkübatör içinde otomatik bir sistem kullanılarak, sağlıklı sağlamak mümkündürdoku, daha fazla zaman noktalarında görüntüleri toplamak ve aynı alan her karede yakalanmasını sağlamak için. Son yıllarda birçok entegre mikroskop doku inkübatör, geliştirilen bu klinik pratikte 9 değil aynı zamanda kök hücre ve kanser araştırmalarında 10,11 değil sadece yararlı olmuştur.
Burada embriyonik fare koklear eksplantlannın uzun vadeli canlı görüntüleme için bir protokol mevcut. Biz set zaman noktalarında çoklu numunelerin görüntüleri yakalamak için kapasitesine sahip standart bir CO 2 inkübatör içinde otomatik bir mikroskop sistemi kullanın. Sistem, bir kuluçka makinesi içine yerleştirilmiş ters çevrilmiş bir mikroskop oluşur. Numuneler, her bir zaman noktasında çok sayıda örneğin görüntüleme sağlayan döner bir kürsü yerleştirilir. Aydınlatma, görüntü yakalama ve kürsünün dönme Metamorph yazılımı aracılığıyla işletilen otomatik bir sistem tarafından kontrol edilir. Işletim yazılımı kullanarak bir görüntüleme rutin ayarlayarak biz tw kadar aday için bir deney ayarlayabilirsinizen az insan müdahalesi ile o hafta. Bu örnekte biz özellikle büyük ölçekli büyüme ve koklea yeniden düzenlenmesini ve, prosensory bölgeyi göstermek için hem parlak bir alan ve floresan kullanın. Bu deneyde, cochleae. Embriyonik gün E13 üzerinde Sox2 EGFP muhabiri fareler disseke edilecektir In vitro kültürler kurulacak ve daha sonra beş gün içinde görüntülendi.
Kültürler kurulur ve uzun vadeli görüntüleme için sırayla time-lapse mikroskop kurma zaman dikkate alınması gereken birkaç teknik nokta vardır.
Bu koklear eksplantların kültürlenmesiyle için bir alt tabaka olarak temel membran matrisi, ancak alt-tabaka, hücre tipi için uygun olmalıdır. Örneğin, görüntü nöron kültürleri ile, bir fibronektin kaplamasının temin edilmesi için daha iyi olabilir. Kuluçka sıcaklık ve gaz bileşimi, aynı zamanda, doku tipine bağlı…
The authors have nothing to disclose.
Yararlı yorumlar ve yapıcı tavsiye için üç anonim yorumcular teknik yardım için Willy Güneş ve Dr. Kris Gellynck için teşekkür ederiz. Bu çalışma Sunnybrook İşitme Yenilenme Girişimi tarafından finanse edildi
Dulbecco's Modified Eagle media | Gibco | 12430 | Multiple brands manufacture this | http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/classical-media/dmem.html |
Basement membrane extract | Corning | 354230 | Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29 |
|
Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
|
HEPES | Gibco | 5630080 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
|
100 x N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
|
Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | Multiple brands manufacture this http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA |
|
Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170161 | Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s |
|
Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Size number 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29 |
|
Curette | Fine Science Tools | 10080-05 | size 1 mm http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118 |
|
Insect Pins | Fine Science Tools | 26001-35 | Must be stainless Steel http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124 |
|
50 mm plastic dishes | Corning/Falcon | 351006 | Multiple brands manufacture this | |
charcoal | Sigma Aldrich | 05105-250G | Multiple brands manufacture similar items http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA |
|
184 silicone elastomer | Dow/Corning | SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dishes are home made several weeks in advance. Silicone elastomer can be from any supplier.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291 | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system. 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15&products_id=2 |
|
Stereomicroscope | Zeiss | 495101-9804-000 | Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html |
|
Cold Light Source | Zeiss | 000000-1063-182 | Multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html |
|
Fluorescent Stereomicroscope | Leica microsystems | Contact Leica microsystems | Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/ |
|
Incubator Microscope +imaging software | Olympus | Contact Olympus | Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0 |
|
Clean bench | Thermo Scientific | 51029701 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html |
|
CO2 incubator | Thermo Scientific | 3310 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html |
|
Laminar Flow hood | Thermo Scientific | 51026651 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html |