This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.
Het apoplast een goede extracellulair compartiment plantenweefsels die ligt buiten het plasmamembraan en omvat de celwand. De apoplastische compartiment van de bladeren van de planten is de site van verschillende belangrijke biologische processen, waaronder celwandvorming, cellulaire voedingsstoffen en wateropname en export, planten-endofyt interacties en defensie reacties op ziekteverwekkers. De infiltratie-centrifugatie methode is goed gevestigd als een krachtige techniek voor de analyse van de oplosbare apoplast samenstelling van verschillende plantensoorten. De volgens deze methode verkregen fluïdum bekend als apoplast wasvloeistof (AWF). Het volgende protocol beschrijft een geoptimaliseerde vacuüm infiltratie en centrifugeren methode voor AWF extractie uit Phaseolus vulgaris (Franse bonen) cv. Tendergreen bladeren. De beperkingen van deze methode en de optimalisatie van het protocol voor andere plantensoorten worden besproken. De teruggekregen AWF kunnen worden gebruikt in een breed scala van downstream Experiments die proberen de samenstelling van de apoplast karakteriseren en hoe ze varieert in reactie op plantensoorten en genotype, plantenontwikkeling en milieuomstandigheden, of om te bepalen hoe organismen groeien apoplast vloeistof en reageren op veranderingen in de samenstelling.
De plant apoplast is de intercellulaire ruimte die plantencellen omringt. Dit is een dynamische omgeving waarin veel metabole en transportprocessen plaatsvinden. De belangrijkste structurele component van de apoplast de celwand, dat is gemonteerd en gemodificeerd door enzymen, structurele eiwitten en metabolieten zich in de apoplast. Bij gezonde plantencellen de apoplast wordt over het algemeen gehandhaafd in een zure toestand waardoor aminozuren, suikers en andere voedingsstoffen uit de apoplast te importeren naar het cytoplasma door H + symport 1. Tijdens sucrose vervoer, sucrose moves uit fotosynthetische bronnen via de apoplast en in floëem vaatstelsel; sucrose wordt vervolgens getransporteerd door een osmotische potentieel onderhouden door apoplast invertasen splitsen sucrose in de gootsteen organen 2. Suikers en andere voedingsstoffen opwaarts getransporteerd en accumuleren in stomatale holten transpiratie stroom 3.
"> De apoplast vertegenwoordigt ook een ecologische niche waar veel pathogenen stellen hun parasitaire levensstijl. Bacteriële plantpathogenen de mogelijkheid te vermenigvuldigen tot hoge dichtheden in de apoplast, die hun in natuurlijke openingen zoals stomata of door wonden 4. De concentratie van amino zuren en andere stikstofverbindingen in tomaat apoplast bleken voldoende om de voedingsbehoeften van bacteriële en fungale pathogenen 5,6 te kunnen dragen. Primaire afweerreacties tegen microbiële pathogenen komen ook in de apoplast, namelijk de productie van reactieve zuurstof species extracellulair peroxidasen . en oxidasen en de versterking van de celwand door middel van cross-linking en callose depositie 7 De plant celwand is rijk aan secundaire metabolieten met anti-microbiële activiteiten; de biochemische aard van deze secundaire metabolieten varieert tussen soorten 8.Als gevolg van de hierboven vermelded en andere processen, blad apoplastische vloeistof bevat verschillende eiwitten, suikers, organische zuren, aminozuren, secundaire metabolieten, metalen en andere kationen (zoals Mg2 +, K +, Na +, Ca2 +, Fe 2/3 +). Opgeloste stof concentraties in de apoplast van scheuten worden grotendeels gecontroleerd door het saldo van transport processen die zich voordoen tussen de apoplast en het xyleem, floëem en cytoplasma 9. Echter, metabolische reacties en microbiële groei ook te consumeren of produceren apoplastische opgeloste stoffen. De samenstelling van de apoplast is bekend dat verschillen plantensoorten en genotypes en als reactie op omgevingsfactoren zoals licht, voeding en biotische en abiotische stress 9 verandert. Door het bestuderen van de samenstelling van de apoplast en hun wijzigingen, zoals eigenschappen zoals redox- en osmotische potentiaal, pH, nutriënten / metaboliet beschikbaarheid en enzymactiviteiten, kan men nieuwe inzichten in hoe planten re krijgenspond aan hun omgeving. Inzicht of karakteriseren van de moleculaire veranderingen die optreden in de apoplast oplossing is gecompliceerd omdat het een ruimtelijk gestructureerde en dynamische compartiment waarin metabolieten en / of ionen vluchtige, voorbijgaande of geassocieerd met de celwand en plasma membraan kan zijn. Bovendien worden verschillende analytische technieken vereist om alle verschillende chemische typen bestrijken.
De samenstelling van het oplosbare apoplast bestuderen fluïdum heeft meestal uit het weefsel te extraheren. Verschillende methoden bestaan uittreksel apoplast fluïdum uit verschillende weefsels, waaronder een nieuw voorgestelde filter strookmethode 10, maar de meest gevestigde extractiemethode voor bladeren infiltratie-centrifugatie. Deze techniek is eerder geëvalueerd 11-13 en Lohaus et al. 2001 14 zorgen voor een grondig onderzoek van vele van de technische parameters van de methode. Zoals geïmpliceerd door de naam, de infiltratie-centrifugaleking techniek Twee-staps werkwijze die in wezen omvat de vervanging van de apoplastische luchtruim met een waterige infiltratie vloeistof, die mengt met de natieve apoplastische vloeistof, gevolgd door herstel van de infiltratie / apoplastische fluïdummengsel door voorzichtig centrifugeren van de bladeren. Omdat de teruggewonnen vloeistof verdund en niet alle verbindingen in de apoplast (zie hieronder) bevat, wordt deze vloeistof bekend als apoplast wasvloeistof (AWF), of soms intercellulaire wasvloeistof, plaats apoplastische vloeistof. De infiltratie centrifugeren techniek gemakkelijk schaalbaar zodat één of gepoolde AWF monsters voldoende volume te genereren en aan diverse downstream biochemische en analytische technieken (bijvoorbeeld proteïne elektroforese enzymactiviteit metingen, NMR, vele soorten chromatografie en massa spectrometrie). Blad AWF is ook nuttig als een apoplast nabootsen groeimedium voor het bestuderen van de interactie van planten koloniseren microben with hun omgeving 5.
In de volgende protocollen beschrijven we hoe de infiltratie-centrifugeren techniek uit te voeren met behulp van Phaseolus vulgaris cv. Tendergreen bladeren, en bieden een aantal voorbeelden van de downstream-analyses met een focus op metabolomics. Belangrijker nog, methoden ter beoordeling van de kwaliteit van de AWF zijn voorzien, samen met advies om de procedure voor de verschillende blad types te optimaliseren.
Het optimaliseren van het plantenweefsel bron
Biologische en technische variatie groot bij het uitvoeren apoplast extracties, waardoor een zeer gestandaardiseerde werkstroom is nuttig om continuïteit in experimenten verhogen (Figuur 1). Belangrijk is dat de bron van plantenweefsel worden gestandaardiseerd, waaronder bladtype, bladouderdom, groei / milieuomstandigheden en tijd (Tabel 1). Grote verschillen in het gemak waarmee verschillende bladeren geïnfiltreerd en de AWF vervolgens gewonnen door centrifugeren; deze verschillen worden gecorreleerd met huidmondjes nummer, diafragma en mesophyll weerstand 12,14. Zelfs onder verschillende cultivars van P. vulgaris er grote verschillen in het gemak en de opbrengst van de AWF extractieprocedure; bijvoorbeeld bladeren van de Tendergreen ras hier gebruikte ontvankelijker voor AWF extractie met deze methode dan de Canadese Wonder cultivar. BinnenP. vulgaris de eerste echte bladeren zijn de grootste en het makkelijkst te infiltreren, waardoor ze de hand liggende keuze voor apoplastische extracties. Het apoplastische lucht en water volume is aangetoond variëren bladouderdom in verschillende species leidt tot verschillen in AWF extraheerbaarheid 12,14. In P. vulgaris, oudere bladeren worden aanzienlijk moeilijker te infiltreren en de opbrengst minder AWF op centrifugeren; Daarom bladeren werden geoogst wanneer ze volle expansie bereikt. Bladeren die moeilijk vervolgens infiltreren vereisen hogere centrifugeren snelheden naar de AWF te herstellen zijn. Men moet dan ook zorgvuldig screenen verschillende blad soorten en variëteiten, alvorens te beslissen op een tissue bron voor grootschalige AWF extracties.
Plantengroei moeten eveneens zoveel mogelijk gestandaardiseerd binnen het kader van het experiment. Het gebruik van groeikasten voorkeur als zij toestaan constante vochtigheid, temperatuur verlicht intensiteit regimenten worden gehandhaafd. De oogst van bladeren moeten altijd plaats op hetzelfde tijdstip omdat de concentraties van metabolieten, enzymen, etc. variëren gedurende de dagelijkse cyclus 14. Om te vermijden dat de bladeren allemaal dezelfde turgor moeten de planten snel bewaterd voordat (~ 1 uur) het oogsten.
Optimalisatie van blad infiltratie en centrifugeren
Ongewenste cytoplasmatische verontreiniging van de AWF door gedeeltelijke cellysis resulteert wanneer de spanning waarmee de cellen te hoog tijdens de infiltratie of centrifugatiestappen. Daarom moet de procedure voor een bepaalde bladtype een geoptimaliseerd compromis tussen maximale opbrengst en het minimaliseren cytoplasmatische verontreiniging van de AWF zijn. In alle gevallen moet men de laagste centrifugeren snelheid waarmee AWF kunnen worden hersteld naar mogelijke mechanische verstoring van het blad cellen te vermijden gebruiken. Optimalisatie van de centrifugaleting snelheid moet empirisch worden bepaald voor elk blad soort door monitoring van de hoeveelheid teruggewonnen en apoplast besmetting over een bereik van centrifugeren snelheden. Er is waargenomen dat marker enzymactiviteiten, zoals MDH, G6PDH en glucose-fosfaat isomerase, laag blijven totdat een drempel centrifugaalkracht wordt overschreden, waarboven deze activiteiten snel toenemen, waarschijnlijk door cytoplasmatische lekkage 9,12,14. Het gebruik van Parafilm voor ondersteuning tijdens de centrifugatiestap, zoals opgemerkt door Baker et al. 2012 11, kan de werkzaamheid van de AWF extractie verbeteren en kan mechanische beschadiging van het blad veroorzaakt door overmatige vouwen en compressie te minimaliseren. Bovendien is het gebruik van Parafilm verbetert visualisatie van het blad na centrifugeren als een het blad op beschadigingen en volledigheid van de AWF extractie moet onderzoeken.
Nouchi 12 beschrijven de optimalisatie van AWF herstel van cut rijstblad secties, die d zijnifficult te infiltreren en vereisen hogere centrifugeren snelheden tot AWF verzamelen vanwege hun kleine stomataire openingen. Verbeterde bevochtiging van de rijst bladoppervlak, hetzij door voorweken de bladeren in gedestilleerd water of de toevoeging van een oppervlakteactieve stof de infiltratie fluïdum, vergemakkelijkt het infiltratieproces. Een hogere snelheid centrifugeren (6000 xg) werd ook gebruikt, met opvolging van apoplastische verontreiniging 12. Bij gebruik cut paneeldelen er altijd het risico dat cytoplasmatische besmetting vaker zelfs uitgebreid wassen van de wond gebieden liggen; gesneden bladeren moeten daarom alleen wanneer dat nodig is worden gebruikt.
Vele studies gedestilleerd water wordt gebruikt als de infiltratie fluïdum 11. Echter, kunnen verbindingen worden toegevoegd aan de infiltratie fluïdum, zoals zouten of buffers om de extractie van bepaalde apoplastische samenstellingen, vooral eiwitten 13 verbeteren. Lohaus 14 evalueerde het effect van ionische en osmotische kracht on de samenstelling van de herstelde AWF en vond ze te verwaarlozen. Veranderingen in pH van het medium infiltratie kan echter de AWF preparaat 14 beïnvloeden.
Correcte opslag en gebruik van het gewonnen apoplastische vloeistof is belangrijk. AWF is aangetoond dat een overvloed van proteasen en andere enzymen 13,20, en vluchtige organische verbindingen bevatten. Daarom, om wijzigingen in de samenstelling van AWF na herstel is het raadzaam om monsters op ijs of bij -80 ° C anders bewaard blijven verminderen. Bovendien moet enzymatische assays van AWF zo spoedig mogelijk nadat extractie enzym inactivatie tengevolge van de proteolyse, langdurige verdunning of bevriezen-ontdooien.
Het proces van infiltratie verdunt de apoplastische vloeistof en het is vaak noodzakelijk om de omvang van deze verdunning. De centrifugatiestap kan ook verdunnen de AWF met water uit intracellulaire compartimenten. Een verdunningsfactor is nodiged in te schatten in vivo apoplast chemische concentraties er metingen worden verricht op AWF. Een verdunningsfactor is ook nodig om terug concentreren AWF volle sterkte wanneer het wordt gebruikt als een apoplast nabootsen groeimedium voor micro – dus passen in vivo metabolietconcentraties zo nauwkeurig mogelijk. Verscheidene variaties bestaan op de in stap 4 beschreven voor de bepaling van de AWF verdunningsfactor door meting van de verdunning van een marker verbinding toegevoegd aan de infiltratie fluïdum methode. Voor alle methoden de AWF verdunning berekening gaat ervan uit dat de infiltratie vloeistof is niet noemenswaardig geabsorbeerd of verdund door het blad cellen tijdens de AWF herstelproces. Deze veronderstelling is eerder gecontroleerd voor de infiltratie stap 14, maar is niet gecontroleerd voor het centrifugeren stap. De marker verbinding mag ook niet worden geabsorbeerd, getransporteerd of gewijzigd, terwijl in de apoplast. Indigokarmijn is de meest gebruikte en grondig getest van kleurstoffen gebruiktvoor AWF verdunning berekeningen. Indigokarmijn toont een lage absorptie te kationuitwisselingshars en geïsoleerde celwanden en is geschikt gebleken voor AWF berekeningen in Brassica napus, Pisum sativum, Solanum lycopersicum en Glycine max 11,21,22 te zijn. Echter, in sommige blad types, bijvoorbeeld, rijst en komkommer, indigo karmijn bleek niet volledig hersteld na infiltratie, wat zou leiden tot een onderschatting van de AWF verdunningsfactor 12,21. Het ontbreken van herstel van indigokarmijn kan te wijten zijn gevoeligheid voor splitsing in isatine sulfonaat door superoxide 23 die bekend is in de apoplast te produceren, vooral onder spanning 24. Splitsing van indigokarmijn in isatine sulfonaat zal resulteren in een verlies van absorptie bij 610 nm en een verhoging bij 245 nm. Of deze reactie optreedt in belangrijke mate in de apoplast, of dat deze reactie kan worden geremd door de toevoeging van superoxide scavengers te infiltration vloeistof is niet onderzocht tot nu toe. Blauw dextran werd gebruikt in plaats van indigocarmine voor de kwantificering van de AWF verdunningsfactor in rijst verlaat 12, hoewel de stabiliteit en het herstel van AWF is niet gemeld. Als alternatief kunnen radioactief gemerkte verbindingen zoals [14C] sorbitol of andere kwantificeerbare interne standaarden worden gebruikt in plaats van kleurstoffen en de afname van radioactiviteit of concentratie gemeten en gebruikt om de verdunningsfactor berekenen op analoge wijze 11,14,25.
Beperkingen van de techniek
Een paar kanttekeningen bestaan voor de infiltratie-centrifugeren AWF isolatie methode. Ten eerste kan de verdunning van de apoplast tijdens infiltratie reactie van de plant op te wekken. Als de omliggende bladcellen detecteren een verminderde concentratie voor bepaalde onderdelen van de apoplastische vloeistof, kunnen zij reageren door het uitscheiden verdere metabolieten, verstoring van de interpretatie van de metaboliet concentraties. Ineen evaluatie van dit probleem werd opgemerkt dat noch de tijd tussen infiltratie en centrifugatie of matige verschillen in de ionsterkte van de infiltratie fluïdum invloed op de samenstelling van het geëxtraheerde AWF 14,22. Daarom alle artefacten als gevolg van apoplast verdunning gedacht minimaal zijn.
Een tweede mogelijk nadeel is dat elutie van AWF door centrifugeren niet alle in de apoplast om verschillende redenen moleculen vangen. Sommige verbindingen, met name kationen en eiwitten nauw betrokken bij de negatief geladen celwand en niet elueer met de AWF 13. Andere moleculen zoals eiwitten te groot om efficiënt elueren uit de apoplast naar het centrifugeren toerentallen die 14 zijn. Reactieve zuurstofsoorten zijn een belangrijke klasse van verbinding die in de apoplast, maar door de kortstondige aard van deze verbindingen, en gespecificeerde eisen voor de productie, de presence is niet goed opgevangen door AWF extractie. Het is niet bekend hoe nauwkeurig AWF vertegenwoordigt de in vivo samenstelling van de apoplast vloeistof en kan variëren tussen soorten.
Verschillende tests bestaan om cytoplasmatische besmetting te bepalen, hoewel geen universeel geaccepteerd. Testen van overwegend cytoplasmatische enzymen (bv G6PDH, hexose fosfaatisomerase, MDH) hebben het voordeel dat ze gemakkelijk uit te voeren maar kan niet goed correleren met cytoplasmische lekkage 14,18. De beoordeling van de cytoplasmatische metabolieten (bv hexose- fosfaten, chlorofyl) is misschien meer een indicatie, maar is minder goed uitgewerkt 11. Toch kunnen beide typen assay nuttig voor relatieve kwantificatie van apoplastische verontreiniging tussen monsters. Idealiter meerdere onafhankelijke metingen gebruikt om de integriteit van de AWF monster valideren.
Maar erkent zijn beperkingen, de infiltratie-centrifugatiop techniek die hier beschreven blijft een eenvoudige en robuuste techniek in de studie van apoplastische eiwitten, primaire en secundaire metabolieten en anorganische ionen.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants BB/J016012/1 and BB/E007872/1 from the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) to Gail Preston.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
razor blade | Fisher | 12-640 | |
60 ml syringe | Becton Dickinson | 300865 | |
20 ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
4 inch parafilm | Bemis | PM-996 | |
side arm flask | SciLabware | 12972831 | |
vacuum source | |||
5 ml pipette tips | Fisher | 50-813-28 | |
centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
indigo carmine | Sigma | I8130 | |
microplate reader | Tecan | Infinite 200 | |
96 well plates | Becton Dickinson | 353072 | |
freeze dryer | SciQuip | Christ Alpha 2-4 LD | |
microcentrifuge | biorad | 166-0612EDU | |
oxaloacetic acid | Sigma | O4126 | |
D-glucose-6-phosphate | Sigma | G7250 | |
NADH | Roche | 10128023001 | |
MDH assay kit | Biovision | K654-100 | |
G6PDH assay kit | Sigma | MAK015-1KT | |
G-6-P assay kit | Biovision | K657-100 | |
ribitol | Sigma | A5502 | |
methanol | Sigma | 650471 | |
chloroform | Sigma | 472476 | |
vacuum concentrator | Thermor Scientific | SC250EXP | |
methoxyamine hydrochloride | Sigma | 226904 | |
N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide | Sigma | 394866 |