Análisis rápido y robusto de Celular y Molecular Polarización Inducida por Chemokine Señalización

Summary

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Abstract

Las células responden a la estimulación de quimiocinas por la pérdida de su forma redonda en un proceso llamado polarización, y mediante la alteración de la localización subcelular de muchas proteínas. Las técnicas clásicas de imágenes se han utilizado para estudiar estos fenómenos. Sin embargo, se requiere la adquisición manual de de muchas células, seguido de tiempo cuantificación de la morfología y la co-localización de la tinción de decenas de células. Aquí, un método rápido y potente se describe para estudiar estos fenómenos en muestras compuestas por varios miles de células por medio de un flujo de imágenes citometría de tecnología que combina las ventajas de un microscopio con los de un citómetro. El uso de linfocitos T estimulados con CCL19 y tinción para las moléculas MHC de clase I y actina filamentosa, una estrategia gating se presenta para medir simultáneamente el grado de alteraciones de la forma y el grado de co-localización de los marcadores que se ven afectados por la señalización de CCL19. Por otra parte, esta estrategia gating nos permitió OBSERVe la segregación de actina filamentosa (en el frente) y fosforilados proteínas Ezrin-radixina-Moesin (fosfo-ERM) (en la parte trasera) en las células T polarizadas después CXCL12 estimulación. Esta técnica también es útil para observar el efecto de bloqueo en la polarización de dos elementos diferentes: la inhibición de la polimerización de la actina por un inhibidor farmacológico y expresión de mutantes de la / PKC atípicas vía de señalización Par6. De este modo, se muestra evidencia de que esta técnica es útil para analizar tanto las alteraciones morfológicas y redistribuciones de proteínas.

Introduction

Las quimioquinas son pequeñas proteínas solubles que atraen a las células a ubicaciones especializados ^1. Por lo tanto, participan en la correcta posición de las células en los tejidos, una función crucial en el desarrollo y la fisiología. El sistema inmunológico no es una excepción a esta regla, ya que se basa en la acción de muchos tipos de células diferentes que actúan en concierto para montar una respuesta inmune efectiva. Mediante el control de la ubicación específica de un tipo de célula inmune en un estado dado, quimiocinas son pre-requerido antes de antígenos extraños pueden ser detectados y neutralizados.

En los linfocitos T, en particular, las quimioquinas se unen a receptores específicos de la superficie que, tras el acoplamiento, provocan muchas señales intracelulares (altura de calcio, la fosforilación de ERK, la activación de Rho GTPasas, el aumento de las integrinas de afinidad y alteraciones del citoesqueleto) que favorecen la motilidad celular T ^2,3. A nivel celular, se puede observar alteraciones morfológicas provocados a la estimulación de quimiocina.Estos cambios en las formas de células son especialmente dramática en las células T: células T en reposo tienen una morfología redonda de cordón cuando se viaja en el torrente sanguíneo. Sin embargo, la detección de la presencia de quimiocinas en sitios de inflamación o en la proximidad de los órganos linfoides se va a cambiar la forma de las células T que ahora adoptar una morfología típica de "espejo de mano" que consiste en una forma bipolar: un borde de ataque en la parte delantera y un borde de salida, o urópodo, en la parte posterior ^4. Además, los componentes intracelulares pueden segregar en estas dos regiones opuestas de una célula T polarizada para sostener la migración. Por ejemplo, los filamentos de actina de polimerización aumenta tras la estimulación de quimiocina ⁵ y actina polimerizada se acumula en la parte delantera de una célula T polarizada ^2. Por otro lado, varias proteínas, tales como proteínas fosforiladas de la Ezrin-radixina-Moesin (ERM) de la familia que unen la membrana plasmática a la cortical del citoesqueleto de actina F, re-localizar en el urópodo de polarizadoLas células T ^6. Curiosamente, nosotros y otros han demostrado que se requiere este proceso de polarización para la migración de células T. De hecho, cualquier tratamiento que interfiere con polarización inhibir la motilidad celular. Por ejemplo, la inhibición de la actividad de los miembros de la proteína atípica quinasas C (PKC) de la familia, la polarización celular y PKCζ PKCι bloques de T y su proceso de escaneo migratorio de las células dendríticas ^7. Polarización de las células T también está regulada por Rho GTPasas. Hemos demostrado que la modulación de la actividad de RhoA por la proteína Fam65b descrito recientemente interfiere con los cambios en la morfología de células T y su capacidad para migrar en un ensayo Transwell ^6. Como la polarización es un paso requisito previo para la motilidad celular, por lo que es crucial para poder cuantificar como una lectura principal de las respuestas a quimiocinas. Alteraciones de la forma de la célula se midieron previamente manualmente ^8. Sin embargo, este tipo de cuantificación es muy lento, de modo que por lo general sólo unos pocosdecenas de células se toman en cuenta.

Aquí, un nuevo método se presenta para cuantificar rápidamente el grado de alteraciones de la forma de los linfocitos T expuestos a quimioquinas estimulación. Un flujo de imágenes citometría de la tecnología (véase la Tabla de reactivos específicos / Equipment) se utiliza, que combina las ventajas de un citómetro de flujo y un microscopio ⁹ para cuantificar de manera eficiente la cantidad de células polarizadas en diferentes condiciones de estimulación de quimioquinas. Además de la cuantificación de las alteraciones morfológicas que uno puede medir la firmeza con esta tecnología, también es posible evaluar los cambios en la localización subcelular de algunas proteínas sobre la señalización de quimiocinas.

Protocol

1. Preparación de los linfocitos T Preparar ratón primaria o células T humanas como se describe 10,11. Cultivar las células T humanas en medio completo RPMI con 10% de suero humano AB a una densidad de 2 – 3 x 10 6 células / ml. NOTA: El uso de suero de ternera fetal (FCS) en lugar de suero humano puede provocar la polarización espontánea de una gran fracción de células T humanas en cultivo. Mantener estas células en cultivo durante 4 – 5 días, y otro proceso …

Representative Results

El primer ejemplo elegido aquí se refiere al uso de linfocitos T primarias humanas estimuladas con CCL19. Sin embargo, la misma estrategia se puede utilizar con las células T de ratón primario, líneas de células T o cualquier otro tipo de células sensibles a la estimulación de quimiocina. La estrategia gating que aquí se presenta incluye una serie de ventanas que se seleccionan los eventos enfocados, entonces las células individuales. Por último, la gama de intensidad de fluorescencia se sigue aquí como un ej…

Discussion

Usando una tecnología reciente del flujo de imágenes citometría, una estrategia rápida e informativo gating para analizar los eventos celulares y moleculares inducidos por la estimulación de quimiocinas se presenta. De un solo experimento, se pueden obtener dos tipos principales de información: los cambios en la morfología celular inducida por la estimulación de quimioquinas y la distribución subcelular de proteínas diferentes durante el proceso de polarización. Curiosamente, también se proporciona evidencia…

Materials

Name of the material/Equipment	Company	Catalog number	Comments/Description (optional)
RPMI	Gibco	61870-010
Human serum AB	PAA	C11-021	Pre-heat to inactivate the complement.
Fetal calf serum	PAN Biotech	P30-3300	Pre-heat to inactivate the complement.
Human T cell nucleofactor kit	Lonza	VCA-1002
Murine IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	Warm in 37 °C water bath before use.
Hepes	Gibco	15630-056
Murine CCL19	Peprotech	250-27B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CCL19	Peprotech	300-29B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CXCL12	Peprotech	300-28A	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.
PFA	Electron Microscopy Sciences	157-8-100	This is a 8 % PFA solution in water. Mix volume to volume with 2X PBS to obtain a 4 % PFA solution in PBS.
BSA	Sigma	A3059
Saponin	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 phalloidin	Invitrogen	A12381
FITC-anti-HLA-ABC antibody	Beckman Coulter	IM1838	clone B9.12.1
Anti-P-ERM antibody	Cell Signaling Technology	3149P
ImageStreamx Mark II	Amnis