脊髄損傷の実験的挫傷モデルにおける神経幹細胞移植
Summary
脊髄損傷は、深刻な罹患率および高い死亡率を引き起こす外傷性状態である。本研究では、具体的に、神経幹細胞の移植に続いて、マウスにおける脊髄損傷の挫傷モデルを記述する。
Abstract
脊髄損傷は、神経学的機能障害の複合体により特徴付けられる壊滅的な臨床症状である。脊髄損傷の動物モデルは、損傷に対する生物学的応答を調査し、潜在的な治療法を試験するための両方に使用することができる。外科的に露出した脊髄に送達挫傷又は圧迫傷害病理の最も広く使用されるモデルである。この報告では実験的な挫傷特定傷害パラメータの定義によって再現可能な損傷動物モデルの作成を可能にする無限ホライゾン（IH）インパクター装置を用いて行われる。幹細胞移植は、一般的に、この衰弱状態を硬化させるための潜在的に有用な戦略と考えられている。多くの研究は、幹細胞の種々の移植の効果を評価した。ここでは、CD1マウスにおける細胞の尾静脈注射に続いて、脊髄損傷のために適応する方法を実証する。 I）細胞標識のWi：一言で言えば、我々はのための手順を提供重要なトレーサー番目と、ii）マウスの術前治療、挫傷、脊髄損傷のiii）の実行、および死後の神経前駆体のiv）の静脈内投与。この挫傷モデルは、再生医療のアプローチでは、幹細胞移植の有効性および安全性を評価するために利用することができる。
Introduction
脊髄損傷（SCI）は、スポーツや暴力1、自動車事故のような高エネルギー外傷によって引き起こされる最も一般的な損傷である落ちる。重度のSCIでは、傷害力は神経機能の突然の喪失を引き起こし、神経組織を破壊するか、損害賠償。外傷性SCIは、年齢の10と40年の間に若年成人に頻繁に発生します。それは非常に患者の心身の状態に影響を与え、社会2に莫大な経済的影響を引き起こす。急性期治療アプローチは、多くの場合、おそらくさらなる損傷3-4を減衰させるために、コルチコステロイド、外科的安定化及び解凍の高用量に限定されず、SCI後の運動回復にこれらのメソッドの役割はまだ論争されている。急性組織欠損、外傷および複数の細胞型5-6の変性の原因脱髄および死亡の二次機構の活性化に加えて。機能の回復の程度は、缶10は、損傷部位7で免れる白質の程度と相関させること。
SCIの動物モデルは、損傷に対する組織の生物学的応答を調査し、潜在的な治療法をテストするための両方に使用することができる。さらに、ヒト病理の有用な動物モデルだけでなく、その条件のいくつかの局面を再現しなければならないだけでなく、直接の臨床観察および実験上の利点を提供しなければならない。脊髄損傷の最も広く使用されるモデルは、外科的に露出させた脊髄8に送ら挫傷又は圧迫傷害を伴う。制御重量ドロップ挫傷の開発はSCI研究の歴史の中で重要なマイルストーンを表している。オハイオ州立大学脊髄研究センターは、コンピュータ9により制御される衝撃のパラメータを脊髄の特定の圧縮を誘発するために使用することができ、装置の技術的課題を追求してきた。これは、もともと利用のWiのために設計されました目のラット;後には、マウス10に向けて適用するように変更されました。この種のアプローチの利点は、損傷の生体力学を深く詳細に研究することができ、損傷のパラメータは、再現可能な実験モデルを得るために、より完全な方法で定義することができることであり、したがって、効果のより正確な評価を可能にする機能回復過程に治療をテストしました。
多くの研究は、SCIモデル11における幹細胞の種々の移植の効果を評価した。我々は最近、数時間のマウスドナー12-13の死後、サブ脳室帯（SVZ）から成体神経幹細胞を単離した。この手順では、SCIを硬化させるための再生医療のアプローチで有利であると思われる神経幹細胞と呼ばれる死後の神経前駆体（PM-のNPC）の集団を提供する。本論文では、デモンストレーションを行います：ⅰ）重要なトレーサーPKH26で細胞標識のためのプロトコル、II）SURG外傷性SCIで実行するiCalの手順、および標識された細胞のIII）静脈内（IV）投与。さらに、本研究で、我々は、移植された細胞は、脊髄損傷部位に移動し、主にタンパク質（MAP）2陽性細胞微小管関連に分化することを実証している。さらに、分化は、後肢機能の安定した回復の促進を伴っている。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文では、70 kdyne（重度）の力で無限ホライゾンインパクターを用いて、外傷性脊髄損傷の再現可能なモデルを得るための方法を記載した。大きな力パラダイム（80 kdyne）を使用して、我々は、残念ながら、より高いマウスの死亡率に関連付けられているより深刻な傷害を引き起こす可能性があります。この問題を回避するために、我々は一般的に、関数の緩やかな回復と低死亡率と再現性…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Authors acknowledge the economic support by FAIP (Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), “Neurogel-en-Marche” Foundation (France), Fondazione “La Colonna”.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PKH26GL-1KT | Sigma | 091M0973 | |
| Infinite horizon (IH) Impactor device | Precision Systems and Instrumentation, LLC | Model 0400 Serial 0171 | |
| Gentamycin 10mg/ml | Euroclone | ECM0011B | 1mg/ml in sterile saline solution |
| Isoflurane-Vet 250ml | Merial | B142J12A | |
| Blefarolin POM OFT 10g | |||
| Slide Warmer | 2Biological Instruments | HB101-sm-402 | |
| Scalpel, size 10 | Lance Paragon | 26920 | |
| Small Graefe Forceps | 2Biological Instruments | 11023-14 | |
| Rongeur | Medicon Instruments | 07 60 07 | |
| Micro scissors | 2Biological Instruments | 15000-00 | |
| Absorbable sutures (4/0) | Safil Quick | C0046203 | |
| Hemostat | 2Biological Instruments | 13014-14 | |
| Reflex 7 wound clip applicator | 2Biological Instruments | 12031-07 | |
| 7mm Reflex wound clips | 2Biological Instruments | 12032-07 | |
| NGS | Euroclone | ECS0200D | |
| Triton X 100 | Merck Millipore | 1086431000 | |
| Anti Microtubule Assocoated Protein (MAP) 2 | Millipore | AB5622 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | |
| FluorSave Reagent | Calbiochem | 345789 | |
| Neural stem cells medium | DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/mL; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/mL; Life Technologies) | ||
| DMEM-F12 | Euroclone | ASM5002 | |
| l-glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| putrescine | Sigma-Aldrich | P5780-25G | |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P6149-1MG | |
| Sodium-selenite | Sigma-Aldrich | S9133-1MG | |
| transferrin | Sigma-Aldrich | T 5391 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| Heparin sodium-salt | Sigma-Aldrich | H0200000 | |
| bFGF | Life Technology | PHG0024 | |
| h-EGF | Life Technology | PHG6045 | |
| Syringe 0.33cc 29G | Terumo | MYJECTOR | |
| buprenorphine | Schering Plough SpA | TEMGESIC | |
| eye gel | Bausch & Lomb | LIPOSIC |
References
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