التعامل مع الفأر القطن في الدراسات لتقييم ما قبل السريرية من حال الورم الفيروسات
Summary
Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.
Abstract
Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.
Introduction
الفيروسات حال الورم (OV) تكرار انتقائي في الخلايا السرطانية من خلال استغلال الاختلافات البيوكيميائية بين الخلايا الطبيعية والسرطانية 1،2. هناك نوعان من OVS: تلك التي لا تحتاج إلى طفرة لتحقيق انحلال الورم انتقائية، ويشار إلى الفيروسات التي تحدث بشكل طبيعي من النوع البري وتلك التي يجب أن هندستها لتحقيق انحلال الورم انتقائي. جمع الطفرات ضمن نوع الورم نظرا يحدد طبيعة ميزة النمو انتقائية على الخلايا الطبيعية لOV 2. وقد تجلى سلامة والاستفادة من استخدام OVS في التجارب السريرية 3-7. وعلى الرغم من التقدم في مجال علاج بالفيروسات حال الورم توجد الفجوات بين النتائج ما قبل السريرية والسريرية، مما يوحي بأن هناك حاجة إلى نماذج أفضل لتقييم فعالية مضادة للورم من OVS.
البقري نوع هربس 1 (BHV-1) هو عضو في عائلة فيروسات هربسية، وAlphaherpesviridae فصيلة. BHV-1 initiآتش البقري مجمع أمراض الجهاز التنفسي في الماشية، ويظهر في مجموعة متنوعة واسعة من أعراض تشبه نزلة برد 8،9. BHV-1 يربط مرفق ودخول مستقبلات يستخدمها HSV-1، مثل كبريتات heparan وnectin-1 10. ومع ذلك، فإنه يربط CD155 في مكان nectin-2 10. BHV-1 لديها مجموعة والمضيف ضيق جدا بحيث أنه غير قادر على الدخول بكفاءة وبدء النسخ المتماثل في الخلايا الطبيعية وتحويلها الفئران 3،4،10. وهذا يجعل من استخدام نماذج الفئران التقليدية إشكالية. وقد تجلى القدرة حال الورم من BHV-1 في المختبر 11،12. وقد تبين BHV-1 لبدء النسخ المتماثل في وقتل الخلايا السرطانية البشرية من مجموعة متنوعة من أصول النسيجية، بما في ذلك خلايا سرطان الثدي وسرطان الثدي الشروع في الخلايا 11،12. ومع ذلك، يجب تقييم القدرة انتيتومور من BHV-1 في الجسم الحي في سياق مضيف مناعيا.
اتش الإنسان (الإعلان)، والتيهناك 57 الأنماط المصلية التي تم تحديدها، تتسبب الأكثر شيوعا أمراض الجهاز التنفسي لدى البشر. تم تقييم ناقلات الإعلان حال الورم لفعالية مضادة للورم مع العديد التقدم في التجارب السريرية 13-15. وعلى الرغم من بيانات ما قبل السريرية واعدة، وتراجعت النتائج السريرية قصيرة من التوقعات. وعادة ما يتم استخدام نماذج طعم أجنبي الورم البشري لدراسة فعالية مضادة للورم من ناقلات الإعلان، على الرغم من أنها تظهر الموهن الاستجابات المناعية للفيروس 16،17. وعلاوة على ذلك، ونماذج الفئران مسانج غير قابلة للمتساهلة للإصابة الإعلان، مما يجعل تقييم المضيف الاستجابات المناعية باستخدام هذه النماذج غير عملي 17،18.
تم التعرف على الجهاز المناعي المضيف كآلية الأكثر تأثيرا التي OVS يثير ورم الخلايا الموت 19. ردود انتيتومور بين tolerized وغير tolerized مستضد المرتبطة الورم (TAA) نماذج تختلف ويمكن أن تؤثر بشكل كبير على نجاح العلاج OV. وHSV-1 OV KM100 (ICP0 n212VP16 في عام 1814 20) 20،21 أثار الورم الانحدار في 80٪ من الفئران الحاملة للورم في الفئران التورام الأوسط T مستضد نموذج سرطان الثدي 22. ومع ذلك، في HER-2 نماذج / NEU، وفعالية مضادة للورم من KM100 تنوعت بين الانحدار الكامل 20٪ في الفئران مسانج وورم في ركود المعدلة وراثيا والفئران HER2 tolerized. معا هذه البيانات تبرز أهمية تقييم كامل OVS باستخدام نماذج حيوانية أن ألخص أفضل المشهد المناعة البشري أن نفهم تماما ما هي الميزات تحديد النجاح العلاجي.
يتم استخدام الفئران القطن (Sigmodon hispidus)، السكان الأصليين لأمريكا الشمالية والجنوبية، والأكثر شيوعا كنموذج للعدوى فيروس الجهاز التنفسي المخلوي (كما استعرض في 5). وتستخدم الفئران القطن أيضا في مجال البحوث لمكافحة BHV-1 التطعيم لأنها تلخيص علم الأمراض المرتبطة بأمراض الجهاز التنفسي البقري معقدة 6،23. وعلاوة على ذلك، BHV-1 إصابة الفئران القطنيولد مناعة، الأمر الذي أدى المخاطية المستدام والاستجابات المناعية الجهازية 6،23-25. وقد استمدت خطوط الخلايا من يفية عفوية وosteosarcomas من الغدة الثديية (LCRT) والعظام (CCRT وVCRT)، على التوالي 26. وقد استخدمت الفئران القطن لتقييم فعالية في الجسم الحي من ناقلات الإعلان حال الورم كما هي عرضة للإصابة الإعلان ويحمل علم أمراض مماثلة على البشر 27-29. استخدام نماذج المناعة لتقييم ما قبل السريرية من OVS ليسوا سوى أقل يدل على الردود السريرية للعلاج لكنها لا تأخذ في الاعتبار دور الجهاز المناعي في علاج بالفيروسات حال الورم 30،31. ولذلك، فإن مسانج ونماذج الفئران القطن tolerized ورم سرطان الثدي وعظمية والنماذج ذات الصلة التي لتقييم فعالية ما قبل السريرية من OVS، مثل BHV-1 والإعلان التي لا يمكن دراستها باستخدام نماذج الفئران التقليدية.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cotton rats are highly excitable and have a strong flight response. Therefore, special care should be taken to minimize any undue stress on the animal. The cage setup described will allow for safe and easy capture of the animals, with the placement of the enrichment tube being of the utmost importance. When setting up cages, ensure that the enrichment tubes meet the size and shape requirements, and are placed in proper orientation in the cage. It is also important to ensure that any technicians who might be aiding in ani…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Breanne Cuddington holds a fellowship from the Canadian Breast Cancer Foundation. This work was sponsored by operating grants from the Cancer Research Society and the Canadian Cancer Society Research Institute (formerly the Canadian Breast Cancer Research Alliance). We thank Ann Tollefson (Saint Louis University School of Medicine) for LCRT cells and Dr. Kathleen Delaney and Marion Corrick for technical assistance with cotton rat housing and sedation.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments/Description |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | 11965-092 | May use any brand |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Can prepare in lab, filter to sterilize | ||
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | May use any brand |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | May use any brand |
| Fetal bovine serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| T-150cm2 tissue culture flask | Fisher Scientific | 14-826-80 | May use any brand |
| 1X TypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| 12-well cell culture plate, flat bottom | Fisher Scientific | 08-772-29 | May use any brand, must be tissue culture treated |
| alamarBlue | Life Technologies | DAL1025 | May use an alternative reagent for determination of cell viability |
| 8640 Teklad 22/5 Rodent diet | Harlan | 8640 | |
| 1/8” corncob rodent bedding | Harlan | 7092 | |
| Nestlets | Ancare | – | Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable |
| 50 mL Conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | May use any brand, must be sterile |
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| 70% Ethanol | Can prepare in lab | ||
| 10 % Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | May use any brand |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments/Description |
| NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood) | NAPCO | Model used not currently available | May use any brand |
| Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath | Fisher Scientific | Model used not currently available | May use any brand |
| Reichert Bright-line Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | May use any brand |
| Typhoon Trio BioAnalyzer | GE Healthcare Life Sciences | Model used not currently available | May use any fluorescence plate reader |
| Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader | Tecan | Model used not currently available | May use any fluorescence plate reader |
| Allegra 6R benchtop centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| Table Top Anaesthesia machine | VetEquip | Model used not currently available | May use any brand, must be portable |
| Wahl Peanut Mini Clippers | Wahl | May use any brand of small clippers | |
| Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL | BD | 329464 | May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin. |
| Cotton swabs | MedPro | 018-425 | May use any brand |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
References
- Cervantes-Garcia, D., Ortiz-Lopez, R., Mayek-Perez, N., Rojas-Martinez, A. Oncolytic virotherapy. Ann Hepatol. 7 (1), 34-45 (2008).
- Vaha-Koskela, M. J., Heikkila, J. E., Hinkkanen, A. E. Oncolytic viruses in cancer therapy. Cancer Lett. 254 (2), 178-216 (2007).
- Abril, C., et al. Both viral and host factors contribute to neurovirulence of bovine herpesviruses 1 and 5 in interferon receptor-deficient mice. J Virol. 78 (7), 3644-3653 (2004).
- Nakamichi, K., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Defective infection of bovine herpesvirus 1 in non-permissive murine cells. J Vet Med Sci. 63 (10), 1139-1142 (2001).
- Boukhvalova, M. S., Blanco, J. C. The cotton rat sigmodon hispidus model of respiratory syncytial virus infection. Curr Top Microbiol Immunol. 372, 347-358 (2013).
- Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Induction of immunity in the respiratory tract and protection from bovine herpesvirus type 1 infection by different routes of immunization with recombinant adenovirus. Viral Immunol. 11 (2), 79-91 (1998).
- Hughes, T. C. R., Lilley, C. E., Ponce, R., Kaufman, H. L. Critical analysis of an oncolytic herpesvirus encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for the treatment of malignant melanoma. Journal of Oncolytic Virotherapy. 3, 11-20 (2014).
- Jones, C., Chowdhury, S. A review of the biology of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1), its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and development of improved vaccines. Anim Health Res Rev. 8 (2), 187-205 (2007).
- Jones, C., Chowdhury, S. Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) is an important cofactor in the bovine respiratory disease complex. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 26 (2), 303-321 (2010).
- Hushur, O., Takashima, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Restriction of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) growth in non-permissive cells beyond the expression of immediate early genes. J Vet Med Sci. 66 (4), 453-455 (2004).
- Cuddington, B. P., Dyer, A. L., Workenhe, S. T., Mossman, K. L. Oncolytic bovine herpesvirus type 1 infects and kills breast tumor cells and breast cancer-initiating cells irrespective of tumor subtype. Cancer Gene Ther. 20 (5), 282-289 (2013).
- Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Permissiveness of Human Cancer Cells to Oncolytic Bovine Herpesvirus 1 Is Mediated in Part by KRAS Activity. J Virol. 88 (12), 6885-6895 (2014).
- Small, E. J., et al. A phase I trial of intravenous CG7870, a replication-selective, prostate-specific antigen-targeted oncolytic adenovirus, for the treatment of hormone-refractory, metastatic prostate cancer. Mol Ther. 14 (1), 107-117 (2006).
- Freytag, S. O., et al. Phase I study of replication-competent adenovirus-mediated double suicide gene therapy for the treatment of locally recurrent prostate cancer. Cancer Res. 62 (17), 4968-4976 (2002).
- Benjamin, R., Helman, L., Meyers, P., Reaman, G. A phase I/II dose escalation and activity study of intravenous injections of OCaP1 for subjects with refractory osteosarcoma metastatic to lung. Hum Gene Ther. 12 (12), 1591-1593 (2001).
- Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), 3-5 (1994).
- Tsai, J. C., Garlinghouse, G., McDonnell, P. J., Trousdale, M. D. An experimental animal model of adenovirus-induced ocular disease. The cotton rat. Arch Ophthalmol. 110 (8), 1167-1170 (1992).
- Ginsberg, H. S., et al. A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adenovirus pneumonia. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (5), 1651-1655 (1991).
- Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. Oncolytic virotherapy. Nat Biotechnol. 30 (7), 658-670 (2012).
- Mossman, K. L., Saffran, H. A., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 mutants are hypersensitive to interferon. J Virol. 74 (4), 2052-2056 (2000).
- Mossman, K. L., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 and ICP34.5 counteract distinct interferon-induced barriers to virus replication. J Virol. 76 (4), 1995-1998 (2002).
- Hummel, J. L., Safroneeva, E., Mossman, K. L. The role of ICP0-Null HSV-1 and interferon signaling defects in the effective treatment of breast adenocarcinoma. Mol Ther. 12 (6), 1101-1110 (2005).
- Papp, Z., Middleton, D. M., Mittal, S. K., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Mucosal immunization with recombinant adenoviruses: induction of immunity and protection of cotton rats against respiratory bovine herpesvirus type 1 infection. J Gen Virol. 78 (11), 2933-2943 (1997).
- Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1. Vaccine. 17 (7-8), 933-943 (1999).
- Mittal, S. K., et al. Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD. Virology. 222 (2), 299-309 (1996).
- Steel, J. C., et al. Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors. Molecular Therapy. 13 (1), 123 (2006).
- Toth, K., et al. Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Hum Gene Ther. 16 (1), 139-146 (2005).
- Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).
- Steel, J. C., et al. Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus. Virology. 369 (1), 131-142 (2007).
- Workenhe, S. T., et al. Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy. Mol Ther. 22 (1), 123-131 (2014).
- Sobol, P. T., et al. Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy. Mol Ther. 19 (2), 335-344 (2011).
- Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), (1994).
