3-D imaging e analisi di neuroni infetti<em> In Vivo</em> Con<em> Toxoplasma gondii</em
Summary
Usando questo protocollo, siamo stati in grado di immagine di 160 micron di spessore sezioni di cervello di topi infettati con il parassita Toxoplasma gondii, che consente la visualizzazione e l'analisi del rapporto spaziale tra il parassita encysting e il neurone infetto.
Abstract
Toxoplasma gondii è un obbligato, parassita intracellulare con una gamma ampia di accoglienza, compresi gli esseri umani e roditori. In entrambi gli esseri umani e roditori, Toxoplasma stabilisce una infezione persistente per tutta la vita nel cervello. Mentre questa infezione cervello è asintomatica nella maggior parte delle persone immunocompetenti, nel feto in via di sviluppo o individui immunocompromessi, come sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) pazienti, questa predilezione per la persistenza e nel cervello può portare a malattia neurologica devastante. Pertanto, è chiaro che l'interazione cervelli Toxoplasma è fondamentale per la malattia sintomatica prodotto da Toxoplasma, ma abbiamo poco comprensione dell'interazione cellulare o molecolare tra cellule del sistema nervoso centrale (CNS) e il parassita. Nel modello murino di CNS toxoplasmosi è noto da oltre 30 anni che i neuroni sono le cellule in cui il parassita persiste, ma poche informazioni sono disponibili su qualiparte del neurone è generalmente infettato (soma, dendriti, assoni) e se questo rapporto cellulare cambia tra i ceppi. In parte, questa mancanza è secondario alla difficoltà di imaging e visualizzazione interi neuroni infetti da un animale. Tali immagini richiede un complesso di sezionamento di serie e la cucitura del tessuto fotografato al microscopio elettronico o microscopia confocale dopo immunocolorazione. Combinando diverse tecniche, il metodo qui descritto consente l'uso di sezioni spesse (160 micron) per identificare e celle di immagine intera che contengono cisti, permettendo la visualizzazione e analisi del singolo, neuroni cronicamente infette tridimensionale senza bisogno di immunocolorazione, microscopia elettronica , o sezionamento seriale e cuciture. Utilizzando questa tecnica, possiamo cominciare a capire il rapporto cellulare tra il parassita e il neurone infetto.
Introduction
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di ottenere alta risoluzione, immagini tridimensionali di singoli neuroni che sono infettati dal parassita intracellulare obbligato Toxoplasma gondii.
Toxoplasma è spesso considerato uno dei parassiti di maggior successo per la sua vasta gamma ospite intermedio, che comprende l'uomo e roditori. In entrambi gli esseri umani e roditori, dopo l'infezione acuta attraverso l'ingestione di cibo o acqua contaminati, Toxoplasma è in grado di causare una infezione persistente del sistema nervoso centrale convertendo dalla sua forma replica veloce (il tachizoite) per la sua lenta replicante e encysting forma (il bradyzoite ). In individui immunocompetenti, questa infezione CNS latente è pensato per essere relativamente asintomatica, ma in individui immunocompromessi, come i malati di AIDS o pazienti sottoposti a trapianto, recrudescenza del parassita può portare alla fatale encefalite toxoplasmic 1,2. Inoltre, studi recenti have dimostrato che l'infezione latente da Toxoplasma può portare a cambiamenti comportamentali nei roditori 3,4, anche se il meccanismo rimane sconosciuto.
Sorprendentemente, nonostante questi dati evidenziano l'importanza dell'interazione CNS- Toxoplasma, relativamente poco si sa su questo rapporto, soprattutto a livello cellulare e molecolare. La possibilità di studiare gli aspetti anche semplici dell'interazione cervello parassita è stata ostacolata in parte dalle limitazioni tecnologiche. Ad esempio, la maggior parte del lavoro dimostrando che i neuroni sono le cellule in cui cisti persistono è stato fatto con microscopia elettronica (EM) 5,6. Anche se EM dà alta risoluzione, è ad alta intensità di tempo, di lavoro, e costoso. Immunofluorescenza (IF) saggi sono stati recentemente utilizzato in combinazione con la microscopia confocale per confermare il lavoro fatto da EM 7. Se le analisi sono tecnicamente facili da eseguire e relativamente poco costoso, ma utilizzando queste tecniche per undertand il rapporto spaziale tra la cisti e il neurone infettato richiede la ricostruzione di serie, che richiede molto tempo, tecnicamente difficile, e può portare alla perdita di preziose informazioni. Così, abbiamo sviluppato un metodo che può essere utilizzato con il modello murino di CNS toxoplasmosi e ci permette di immagine la totalità dei neuroni infetti senza EM o immunoistochimica (IHC). Sviluppando tale tecnica, possiamo cominciare a esplorare il rapporto cellulare tra la cellula infettata e la cisti in modo relativamente rapido e poco costoso.
Il metodo abbiamo sviluppato combina più recenti tecniche di compensazione otticamente e sezioni di cervello spessore di imaging mediante microscopia confocale 8 con un sistema che segna in cellule in vivo che sono stati iniettati con proteine parassita 9,10. In questo sistema, abbiamo infettare topi Cre-giornalista che esprimono una proteina fluorescente verde (GFP) solo dopo 11 ricombinazione Cre-mediata con Toxoplasma </em> Ceppi che esprimono una proteina fluorescente rossa (RFP) e iniettano Cre ricombinasi nelle cellule ospiti 9. Questa combinazione ci permette di raccogliere il cervello infetto del mouse dopo l'infezione del sistema nervoso centrale è stabilita, tagliare sezioni di cervello di spessore, e rapidamente individuare le aree di pertinenza immagine trovando la RFP + cisti. È importante notare che, come espressione della GFP cellula ospite dipende unicamente dalla iniezione di Cre da parassiti, infezioni e non su una serie di cellule GFP + non contengono parassiti 10. Poiché l'obiettivo di questo protocollo è quello di essere in grado di immagine intere neuroni infettati, l'attenzione è solo sulla GFP + neuroni che contengono anche un RFP + cisti, ma il protocollo può essere utilizzato anche per l'immagine della GFP + / RFP – neuroni.
Una volta che il cervello infetto è raccolto e sezionata, le sezioni sono resi trasparente glicerolo compensazione. Regioni appropriate di sezioni sono poi ripreso con microscopia confocale, almuggito visualizzazione senza precedenti di cellule ospiti infette e parassiti incistate nella loro interezza. Qui forniamo un protocollo completo per l'identificazione, la compensazione ottica, e di imaging infetti neuroni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dato che i cambiamenti cellulari nelle cellule ospiti infette sono stati collegati a risultati malattia in infezioni da altri organismi intracellulari come l'HIV, la rabbia, e Chlamydia 18,19, abbiamo sviluppato una tecnica che permetta di studiare le interazioni intime che si verificano tra il sistema nervoso centrale ospitare cellulare e Toxoplasma. Il metodo descritto qui realizza questo obiettivo, consentendo immagini efficiente di neuroni con infezione cronica. Prima dello sviluppo di questo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo l'intero laboratorio Koshy per utili discussioni. Ringraziamo Patty Jansma e la University of Arizona Dipartimento di Neuroscienze per la consulenza e assistenza per l'imaging. Ringraziamo anche il laboratorio Porreca per l'uso del loro Vibratome. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health (NIH NS065116, AAK).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Vibratome Series 1000 Sectioning System | Technical Products International, Inc. | Other vibratomes are compatible | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Premium Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| #1.5 Coverslips | VWR | 48393 251 | |
| Diamond Scriber | VWR | 52865-005 | |
| Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml | Western Medical Supply, Inc. | 4165 | |
| AnaSed® Injection Xylazine 20mg/ml | Lloyd Inc. | ||
| ZsGreen Mice | Jackson Laboratories | 7906 | B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J |
| Surgical equipment | Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula. | ||
| Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | These are primary cells from human foreskins. We make these in-house but they may be purchased from outside vendors. | ||
| Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) | HyClone | SH30081.01 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| 200mM L-alanyl-L-glutamine | Corning | 25-015-Cl | |
| 25cm2 Canted neck flask | Fisher Scientific | 1012639 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | VWR | 45000-446 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade | amresco | K813-500ml | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-aldrich | Z359629-1EA | |
| Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-aldrich | H3393-100KU | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 20ml Disposable Scintillation Vials | Fisher Scientific | FS74500-20 | |
| Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof | In-house | 17212945 | This product is purchased from an in-house stockroom. Other companies are compatible. |
| Imaris Software | Bitplane | ||
| Clear nail polish | Other brands are compatible | ||
| 10ml Syringe with Luer-Lok | VWR | BD309604 | Other syringes are compatible |
| Three-way Stopcock | Any brand is compatible | ||
| Hypodermic needle | Any brand is compatible – used to pin down mouse. | ||
| Cell Scraper | Any brand is compatible | ||
| 25G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter | Greiner Bio-One | 450099 | Other brands are compatible |
References
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