Electroporation של effectors בקטריאלי פונקציונלי לתאי יונקים
Summary
Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.
Abstract
המחקר של אינטראקציות חלבון בהקשר של תאי חיים יכול ליצור מידע קריטי על לוקליזציה, דינמיקה, ושותפים באינטראקציה. מידע זה הוא בעל ערך במיוחד בהקשר של אינטראקציות מארח הפתוגן. חלבוני הפתוגן רבים לתפקד בתוך תאי מארח במגוון רחב של דרך כגון, מה שמאפשר התחמקות ממערכת החיסון המארחת וההישרדות בסביבה תאית. ללמוד אינטראקציות מארח תאי הפתוגן-חלבון אלה, מספר גישות נמצאות בשימוש נפוץ, ובם: בזיהום vivo עם זן לבטא חלבון מתויג או מוטציה, או הקדמה של גני הפתוגן באמצעות transfection או התמרה. לכל אחת מהגישות הללו יש יתרונות וחסרונות. חפשנו אמצעי להציג ישירות חלבונים אקסוגניים לתאים. Electroporation משמשת בדרך כלל כדי להציג חומצות גרעין לתאים, אך הוחל חלבונים לעתים רחוקות יותר אם כי בסיס biophysical הוא בדיוק אותו הדבר.Electroporator סטנדרטי שימש להציג effectors חיידקי זיקה מתויגת לתאי יונקים. תאי אפיתל מקרופאג ועכבר אנושיים היו בתרבית בשיטות מסורתיות, מנותקים, והניחו בcuvettes electroporation פער 0.4 סנטימטר עם חלבון אקסוגני חיידקים פתוגנים של עניין (למשל סלמונלה Typhimurium GtgE). לאחר electroporation (0.3 קילו וולט) ותקופת החלמה (4 שעות) קצרה, חלבון תאיים אומת על ידי fluorescently תיוג החלבון באמצעות תג זיקתה ובחינת חלוקת מרחב ובזמן על ידי מיקרוסקופ confocal. חלבון electroporated הוצג גם להיות פונקציונלי בתוך התא ומסוגל סחר subcellular נכון ואינטראקציה בין חלבונים. בעוד החלבונים אקסוגניים נטו לצבור על פני השטח של התאים, היו לי דגימות electroporated עליות גדולות ביחסי ריכוז מפעיל תאיים לדגירה לבד. הפרוטוקול הוא פשוט ומהיר מספיק כדי להיעשות בapאופנת arallel, המאפשרת לאפיון תפוקה גבוה של חלבונים בתאי מארח הפתוגן כוללים מיקוד ותפקוד של חלבוני ארסיות subcellular.
Introduction
חיידקים גראם-שלילי רבים להעסיק מערכות הפרשה מיוחדות להזריק חלבונים הקשורים לאלימות (המכונים מפעילים) ישירות לתוך תאי מארח 1-5. יש לי effectors אלה מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים כוללים: דיכוי חסינות מארח, שינויי cytoskeletal, שינוי של סחר תאיים ואיתות, שינויי תעתיק, ושינויי פרוטאזום מארח 6-9. הפונקציות של כמה effectors ידועות, עם זאת מטרות המארח ופעולה הביוכימית (ים) של רבים אחרים עדיין לא נקבעו. תוך השוואת wild-type וזיהומים חיידקיים רקומביננטי היא גישה תקפה ללמוד מנגנוני אלימות מפעיל תאיים, הוא לעתים קרובות יתרון להציג מפעיל בודד לתוך התא המארח. לפיכך, שיטות פשוטות להצגה ואפיון חלבוני מפעיל חיידקים בהקשר של תאי מארח רצויה מאוד.
פישוט wi הניתוח הניסיוניה מפעיל יחיד הוא קריטי כפי שאולי יש effectors אחרת פונקציות יריבה או מיותרות. כדי להשיג פישוט זה, חוקרים הציגו בעבר מקרו-מולקולות לתוך תאים על ידי שיטות רבות ושונות, כוללים התמרה ויראלית 10, microinjection 11, לגרד טעינת 12,13, איחוי תאים עם microinjection המושרה כימי 14, ריאגנטים חלבון קניינית "transfection" 15, משקעי סידן זרחה 16, וelectroporation 17-20. המולקולות הציגו נעות בין חומצות גרעין כוללים מיני DNA, RNA, וRNAi לחלבונים, צבעי תא-חדיר, ונוגדנים למטרות תאיות 21,22. יש כמה שיטות מגבלות כוללים הסוג של פולימר שיכול להיות מוצג, וניתוחים במורד הזרם מסוימים עשויים להיות מוגבלים בשל רעילות גבוהה סלולרית, מנגנונים מזיקים של פעולה, יעילות נמוכה, או יעילות מבוא. Transfection, often שימוש בשיטה לביטוי גנים של חיידקים בתאי יונקים, סובל גם המגבלה שכמה סוגי תאי מארח רלוונטיים, כגון מקרופאגים ותאים ראשוניים, הם עמידים במיוחד לקראת transfection. מעבר לכך, קשה לשלוט ברמות של חלבון חיידקים המיוצר על כניסתה של דנ"א זר.
יש הרבה עבודה שהוקמה electroporation של חומצות גרעין לשני תאי החיידקים ויונקים כטכניקת מעבדה משותפת; עם זאת, יש מחקר מתמשך לשיטות הטובות ביותר לאספקת חלבונים לתאים בתנאים פיסיולוגיים. דיווחים על transfection חלבון מבטיחים, אך דורשים חומרים כימיים ואופטימיזציה יקרים. הרצון להציג effectors חיידקים שעלולים להיות רעיל למגוון רחב של יעדי תא עם עלות מינימאלית הוביל אותנו לשקול electroporation כשיטה ללימוד חלבונים אלה in vivo.
electroporation החלבון 23-25 הוא נפגשהוד להציג חלבונים לתאים חיים באמצעות electropermeabilization, הידוע גם באלקטרו-transfection או אלקטרו-הזרקת 26. טכניקה זו משתמשת פולסים חשמליים בעוצמה גבוהה כדי ליצור נקבוביות בקרום תא. נקבוביות הפיכים אלה מאפשרים מקרומולקולות כי הם בדרך כלל לא נכללו מהחלל תאית להיכנס לתא. לאחר ההסרה של השדה החשמלי החיצוני, הקרום יכול לחתום מחדש, המאפשר לתא כדי לשמור על מולקולות שעברו דרך הנקבוביות 27,28.
Electroporator סטנדרטי שימש במחקר זה כדי להציג באופן עקבי effectors חיידקים לשני תאים כמו מקרופאג-עכבר ותאי האפיתל אנושיים. השיטה היא מהירה, יעילה, ולא יקר, ללא ירידה משמעותית בכדאיות סלולרית. ניתן דמיינו חלבונים הציגו באמצעות מיקרוסקופיה immunofluorescence או משמשים למבחנים פונקציונליים. זה הודגם באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כסטנדרט שאינו רעיל, כמו גםשני חלבוני סלמונלה מפעיל, SspH1 וGtgE. אנו מציעים electroporation חלבון ככלי נוסף ברפרטואר לחקר חלבוני ארסיות חיידקים ואת תפקידיהם בתאי מארח אוקריוטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
effectors מופרש מחיידקים פתוגניים התפתחה כדי לתפקד בסביבת התא המארח, ולכן כדאי ללמוד אותם באתרו בתוך הפונדקאי. מבוא של effectors הספציפי של עניין לתאי מארח מאפשר אינטראקציות הפתוגן-המארח הרלוונטי כדי להיחקר בבידוד ללא הפרעות מחלבונים חיידק אחרים. המטרה הייתה לחקור electrop…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIGMS, National Institutes of Health (GM094623). Significant portions of this work were performed in the Environmental Molecular Sciences Laboratory, a DOE/BER national scientific user facility located at the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL is operated for the DOE by Battelle under Contract DE-AC05-76RLO1830.
Materials
| Material or Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus – Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
References
- Mota, L. J., Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).
- Galan, J. E., Collmer, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284, 1322-1328 (1999).
- Hueck, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).
- Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. Assembly and function of type III secretory systems. Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).
- He, S. Y. Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).
- Dean, P. Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection. FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).
- Espinosa, A., Alfano, J. R. Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity. Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).
- Orchard, R. C., Alto, N. M. Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens. Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).
- Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
- Sreelatha, A., et al. Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).
- McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).
- Lafon, M., Lafage, M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus. The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).
- Kriegler, M. P., Livingston, D. M. Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells). Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).
- Nossa, C. W., et al. Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).
- Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells. Mutation Research. 225, 49-53 (1989).
- Cortes, F., Ortiz, T. Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells. International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).
- Cortes, F., Ortiz, T. Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments. Mutation Research. 246, 221-226 (1991).
- Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method. Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).
- Lewis, R. Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery. Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).
- Kotzamanis, G., et al. CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).
- Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake. Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).
- Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).
- Prasanna, G. L., Panda, T. Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology. Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).
- Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. Theory of electroporation: A review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).
- Weaver, J. C. Electroporation theory. Concepts and mechanisms. Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).
- McAteer, J. A., Douglas, W. H. Monolayer culture techniques. Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).
- Ho, T. D., et al. Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).
- Niemann, G. S., et al. Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants. Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).
- Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).
- Haraga, A., Miller, S. I. A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1. Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images. Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino … [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).
- Kimple, M. E., Sondek, J., et al. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan … [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).
