Géis de poliacrilamida para Invadopodia e Tração Força Ensaios sobre as células cancerosas
Summary
Rigidez mecânica no microambiente tumoral desempenha um papel crucial na condução de comportamento maligno, aumentando a atividade invadopodia e actomiosina contratilidade. Usando géis de poliacrilamida (PaaS), invadopodia e força de tração ensaios podem ser utilizados para estudar as propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas em resposta a matriz rigidez.
Abstract
Tecidos tumorais rígidas têm sido fortemente implicado na regulação da migração e invasão de células de cancro. Migração invasivo através de tecidos de ligação cruzada é facilitada por saliências ricos em actina chamados invadopodia proteoliticamente que degradam a matriz extracelular (ECM). Atividade Invadopodia demonstrou ser dependente de rigidez ECM e contráteis da célula cancerosa forças sugerindo que sinais de rigidez pode regular estas estruturas subcelulares através actomiosina contratilidade. Propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas podem ser correlacionados in vitro utilizando invadopodia e força de tração ensaios baseados em géis de poliacrilamida (PaaS) de diferentes factores de rigidez. Propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas podem ser correlacionados in vitro utilizando invadopodia e força de tração ensaios baseados em géis de poliacrilamida (PaaS) de diferentes factores de rigidez. Enquanto existem algumas variações entre os dois ensaios, o protocolo aqui apresentado fornece um método para a criação de PAA thno pode ser usado em ambos os ensaios e são facilmente adaptáveis às necessidades biológicas e técnicas específicas do usuário.
Introduction
A rigidez da ECM associado a tumor tem sido identificada como um factor significativo na condução comportamento maligno, aumentando a contractilidade actomiosina 1-3. Embora este efeito principalmente tem sido demonstrado com células de cancro da mama, a rigidez da matriz foi encontrado para alterar as propriedades invasivas das células derivadas de uma variedade de cancros o que sugere que 4-8 rigidez tumoral podem desempenhar um papel em outros tipos de cancros. Para penetrar tecidos reticulados durante a migração invasiva, as células cancerosas utilizam saliências adesivas ricas em actina conhecidos como invadopodia que localizar proteinases para degradar focally o ECM 9. Invadopodia são consideradas uma característica de células invasivas e têm sido implicados na invasão de células de tumores e metástases 10,11. Os trabalhos anteriores mostraram que a rigidez da matriz pode regular números invadopodia e associado ECM degradação 4,12 através da atividade da miosina II e proteínas mechanosensitive 12. Considerando acorrelação entre a densidade e a agressividade do tumor do cancro 13,14, estes resultados sugerem um mecanismo pelo qual as células cancerígenas podem responder aos tecidos rígidos de tumor para dirigir a invasão e metástases através de actomiosina contractilidade.
Em rigidez MEC in vitro e em densidade do tecido vivo têm sido mostrados para regular o comportamento invasivo das células cancerosas 1,15-17. Enquanto actomiosina contractilidade parece ser importante neste processo, estudos actual conflito a respeito de se a capacidade metastática está correlacionada com o aumento ou a diminuição da força contráctil 6,18-20. Além disso, não se sabe se essas forças mediar diretamente a atividade invadopodia 21. Recentemente, descobriu que forças contráteis da célula cancerosa eram dependentes de rigidez da matriz e foram preditivos de degradação ECM por invadopodia 5. Estes resultados sugerem que as forças celulares podem desempenhar um papel importante na progressão do cancro pela mediação invadopodia acdade em resposta às propriedades mecânicas do microambiente do tumor.
Para correlacionar propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas, 5, modificamos um protocolo para a criação de PAAs com diferentes rigidez que anteriormente foi usado para investigar a atividade invadopodia dependente da rigidez 4,12,22. Por reticulação química fibronectina do plasma humano ao longo do PAA, estes hidrogéis modificadas podem ser utilizadas como a base para ambas invadopodia e ensaios de força de tracção para assegurar que as células experimentado as mesmas em ambas as experiências rigidez 5. Nos ensaios invadopodia, a fibronectina fornece um domínio de ligação natural para gelatina para ligar o ECM sobreposta para o SAP para detectar a degradação da matriz. Nos ensaios de força de tração, a fibronectina fornece um ligando para adesão celular direto para detectar deslocamentos de microesferas utilizadas para calcular as forças de tração celulares. Este método resulta em o que temos chamado macio, duro,e PAAs rígidas que são obrigados a pratos com fundo de vidro e têm módulos elásticos, E, de 1023, 7307 e 22692 Pa 5, que abrange a gama de propriedades mecânicas reportados para os tecidos normais e cancerosos 23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apresenta-se um método para a fabricação de PAA que podem ser usados como a base para invadopodia força de tracção e ensaios para correlacionar comportamentos celulares invasivos e contrácteis. Enquanto PAAs têm sido muito utilizados para analisar os efeitos da rigidez nas células e calcular forças de tração 18,24,27, este protocolo é o primeiro a desenvolver ensaios paralelos baseados em PAAs com os mesmos factores de rigidez para correlacionar comportamentos celulares invasivos e contrát…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Acrylamide (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Acrylic acid NHS ester | Sigma-Aldrich | A8060 | prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO |
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Life Technologies | A22283 | can also use rhodamine |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | prepare fresh 10% solution in 1X PBS |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | use six drops to fill microwells |
| BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Bovine serum albumin | RPI | A30075 | make 3% for blocking solution in 1X PBS and store in 4 °C |
| Coverslips (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| dialysis tubing | Sigma-Aldrich | D9777 | pre-equilibrate in borate buffer for 15-30 min |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | use to make invadopodia medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | use to make acrylic acid NHS ester solution |
| Epidermal growth factor | Life Technologies | PHG0311 | use to make invadopodia medium |
| Ethanol | PHARMCO-AAPER | E200 | dilute with ultrapure water to 70% |
| FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | use to make invadopodia medium |
| FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | protect from light |
| Gelatin | Polysciences | 00639 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| Glass bottom dishes (35 mm coverslips) | MatTek | P35G-0-14-C | coverslips are uncoated |
| Glutaraldehyde (25%) | Polysciences | 01909 | dilute with 1X PBS to 0.5% |
| goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody | Life Technologies | A21050 | |
| Human plasma fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles |
| KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | use to make 10X PBS stock |
| mouse anti-cortactin 4F11 antibody | EMD Millipore | 05-180 | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | use to make 10X PBS stock |
| NaCl | RPI | S23020 | use to make 10X PBS stock and borate buffer |
| NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | dilute with ultrapure water to 0.1 N |
| Nu-Serum (low-protein serum) | BD Biosciences | 355500 | use to make invadopodia medium |
| Paraformaldehyde | Acros | 416785000 | typically make 10% stock in 1X PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl) |
| PBS (sterile) | Cellgro | 21-040-CV | use for cell culture |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | use to make invadopodia medium |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1X PBS |
| sodium metaborate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | S0251 | use to make borate buffer |
| Sucrose | RPI | S24060 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | make 10% stock in 1X PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1X PBS for staining |
References
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
- Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
- Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
- Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
- Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572 (2012).
- Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
- Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
- Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
- Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
- Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
- Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
- Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
- Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
- Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015 (2011).
- Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
- Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A., Coutts, A. S. . Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. 1046, 171-189 (2013).
- Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
- Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
- Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
- Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
- Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
- Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).
