Zebravis Keratocyte Explantaten naar Collective Cel Migratie en reepithelialization in Cutane Wound Healing Bestudeer

Summary

Zebravis keratocyten migreren celvellen van explantaten en verschaffen een in vitro model voor de studie van de mechanismen van collectieve celmigratie in de context van epitheliale wondgenezing. Deze protocollen detail een effectieve manier om primaire explantkweken stellen voor gebruik in collectieve celmigratie assays.

Abstract

Vanwege hun unieke beweeglijke eigenschappen, vis keratocyten losgekoppeld van explantkweken zijn lang gebruikt om de mechanismen van cel migratie te bestuderen. Wanneer echter explantaten worden vastgesteld, deze cellen gezamenlijk bewegen ook behoud vele eigenschappen die afzonderlijke keratocyten een aantrekkelijke model migratie studeren: hoge snelheden van motiliteit uitgebreide actine-rijk lamellen met een loodrechte actine kabel, en betrekkelijk constante snelheid en trekrichting. In het begin van explantaten, de snelle onderlinge omzetting van cellen migreren individueel met die migreren collectief maakt de studie van de rol van cel-cel adhesie bij het bepalen van de wijze van migratie, en benadrukt de moleculaire banden tussen de twee modi van de migratie. Cellen in latere explantaten verliezen hun vermogen om snel en gezamenlijk migreren als epitheliale naar mesenchymale overgang plaatsvindt en genen geassocieerd met wondgenezing en ontsteking op differentiële expressie. Aldus kan keratocyte explantaten dienen als een in vitro model voor de reepithelialization die tijdens cutane wondgenezing en een uniek systeem om mechanismen van collectieve celmigratie te onderzoeken in het kader van een bepaald programma van genexpressie verandert vertegenwoordigen. Verschillende mutant en transgene zebravis lijnen beschikbaar, waardoor explantaten worden vastgesteld uit vis met verschillende genetische achtergronden. Hierdoor kan de rol van de verschillende eiwitten in deze processen uniek worden aangepakt. De hier beschreven protocollen beschrijven een eenvoudige en effectieve methode voor het vaststellen van deze explantkweken voor gebruik in verschillende assays inzake collectieve celmigratie.

Introduction

Studies van celmotiliteit traditioneel geconcentreerd op individuele migrerende cellen. Keratocyten gekweekte uit vis en amfibie explants hebben bewezen een krachtig model systeem om de mechanismen van celbeweeglijkheid bestuderen met behulp van zowel experimentele en wiskundige modellering benadert ^1-6 zijn. Experimenten op individueel migrerende cellen wordt bevorderd door de snelle, glijden beweging van de cellen, terwijl een gelijkmatige vorm, snelheid en richting. In vivo cellen bewegen vaak samen met behoud van cel-cel contacten, vooral tijdens de embryogenese, wondheling en metastase. Zo collectieve cel migratie is een groeiende en steeds meer prominente gebied van onderzoek binnen het gebied van de cel migratie. De collectieve migratie van deze cellen is onlangs beschreven ⁷ en het heeft vele unieke eigenschappen die het een krachtig systeem van collectieve cel migratie te bestuderen in een wondgenezing model te maken.

ove_content "> Wanneer schalen worden geplukt van een verdoofde volwassen zebravissen, blijft wat epitheelweefsel op de onderkant van de schaal. Als kweekmedium wordt toegevoegd, deze epitheelcellen of keratocyten, migreren snel collectief eenheid van de schaal. De explantaatkweek kan worden gezien als een epitheliale wondgenezing model, waarin de cellen migreren van het explantaat zoals zij in de voorlopige matrix van een wondbed een intact epitheel herstellen. Recente gegevens suggereren dat deze ex vivo kweken bootst vele functies van in vivo wondgenezing in volwassen zebravissen. wondsluiting bekijken ⁸ vertalen naar een migratie snelheid vergelijkbaar met die waargenomen in de ex vivo systeem ^7. Bovendien, in een in vivo model wondgenezing, behandeling met warfarine suggereert dat hemostase heeft geen effect op koers van genezing, terwijl behandeling met hydrocortison immuunrespons verminderen niet reepithelialization ⁸ vertragen </sup>. Zoals de zebravis bloedt niet wanneer de schaal wordt verwijderd uit het dier, hemostase is geen grote speler. Hoewel we immuuncellen gevonden in explantaten, hebben we de effecten zij zouden kunnen hebben op collectieve celmigratie niet onderzocht.

De hier gepresenteerde protocol beschrijft hoe zebravis keratocyte explantkweken dat consistentie en reproduceerbaarheid voor gebruik in vele biologische assays kan verzekeren. Deze explantkweken zijn bijzonder dwingend in vitro model voor collectieve celmigratie om verschillende redenen. Ten eerste, de zebravis keratocyten zijn primaire cellen die worden gebruikt binnen enkele uren na oprichting explantkweken. Daarom zijn deze cellen niet de morfologische en genexpressie veranderingen geassocieerd met een passage van primaire cellen ^9-13 ondergaan. Ten tweede, dit systeem is een model voor de studie van reepithelialization reactie op verwonding ¹⁴ en het kader van de respons op verwonding, een epitheliale naar mesenchymale transition (EMT) wordt geïnitieerd zoals blijkt uit veranderingen in genexpressie en herschikkingen van het cytoskelet ^14,15. Zo hebben de achtergrond veranderingen in genexpressie en motiliteit die voorkomen in onbehandelde cellen gekarakteriseerd en een context verandert met behandeling interpreteren. Bovendien, de vis keratocyte en de menselijke keratinocyt functioneel gelijkwaardig; zowel de primaire epitheelcellen van hun respectieve soorten en spelen een belangrijke rol in epitheliale wondgenezing. Ten derde, volwassen zebravissen winnen erkenning als modelsysteem voor diverse humane ziekten waaronder ^16-18 melanoom en andere kankers ^19-21, cutane wondgenezing ^8,14 en weefselregeneratie ^22-24.

Technische voordelen van dit model systeem zijn even overtuigend. Een groeiend aantal mutant en transgene lijnen zijn verkrijgbaar bij non-profit, gecentraliseerde faciliteiten. Met name de zebravis Mutation Project (ZMP) En het Wellcome Trust Sanger Institute beoogt een knockout allel in elk eiwit coderende gen in de zebravis genoom maken. Momenteel hebben zij gemuteerde 11.892 genen, ongeveer 45% van het genoom, met 24.088 allelen gekarakteriseerd. Daarnaast ZMP accepteert voorstellen en zal knock-outs kosteloos te genereren. Recente werkwijzen gen knockdown in larven en volwassen zebravissen ^25-28 flexibiliteit bieden om de functie van ontwikkelings belangrijk genen waarvoor transgene benaderingen problematisch of onpraktisch bestuderen.

Vanwege hun extreem hoge snelheden van beweeglijkheid van ~ 145 um / uur kort na instelling van culturen ²⁹ kunnen assays snel af (gewoonlijk 24 uur of minder). Zoals experimenten snel kan worden afgerond en culturen groeien goed bij RT, een aantal van de technische hindernissen in verband met zoogdiercellen migratie assays waarbij videomicroscopie worden vermeden. Bovendien, in de leeftijd van aanscherping onderzoeksbudgetten, zebrafachtig zijn gemakkelijk en goedkoop onderhouden.

De structuur en het gedrag van de explantatie is complex. Als de vis niet bloeden wanneer de schaal wordt verwijderd, is het onwaarschijnlijk dat meer dan de oppervlakkige epidermale lagen worden verwijderd met de schaal. Keratocyten lijken het overheersende celtype in het explantaat wanneer weegschaal eerst worden verwijderd uit de vis als de meeste cellen blijken vlek met een anti-E-cadherine antilichaam ^14. Bovendien is er geen bewijs van fibroblasten in de initiële kweek zoals beoordeeld door de afwezigheid van vimentine kleuring met immunofluorescentie ^14. Echter, met herhaalde schaal verwijderen, lijken er tal van neutrofielen in de explantatie (zie video 1). We hebben deze cellen zoals neutrofielen gebaseerd op morfologische waarnemingen van hun grootte, snel motiliteit en de migratie van de cellaag die bij blootstelling aan LPS (gegevens niet getoond). Bovendien, deze cellen vlek helder with een antilichaam tegen neutrofiel cytosol factor en met een verscheidenheid van secundaire IgG antilichamen, wat aangeeft dat zij over grote FcR op hun oppervlak (gegevens niet getoond). Meerdere cellagen aanwezig zijn binnen de explantatie. Confocale microscopie onthult de aanwezigheid van een enkele laag bij bovenrand meer dan twee lagen van keratocyten nabij de schaal neutrofielen zichtbaar boven, onder en tussen de cellen keratocyte vellen.

Op vroege tijdstippen cellen op de rand van de meerlaagse explantaat polariseren, initiëren collectieve migratie van keratocyten van het explantaat op beginsnelheden van ~ 145 um / uur. Het gebied dat door de explantatie snel toe, wat leidt tot cel verspreiden, spanning in het vel, en een verminderde snelheid van tevoren van de voorrand. Rapid interconversies tussen leider en volger cellen worden waargenomen op de voorste rand tijdens de vorming en de sluiting van spontaan gevormde gaten in de plaat ^7. Aangezien deEMT proces gestart met de explantatie blijft, het vel fragmenten en de keratocyten verliezen hun gespecialiseerde, snelle beweeglijkheid. Genexpressie en morfologische veranderingen overeenstemming met EMT, wondgenezing en ontstekingsreacties optreden binnen 7 dagen kweken met explantaten wordt nog gedurende ongeveer 10 dagen ¹⁴ beschouwd.

Protocol

Dit protocol voldoet aan de AVMA Dierenwelzijn Principes voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en is goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) in het Midwesten University goedgekeurd. 1. Voorbereiding van de anesthesie, apparatuur, & Media Dechloreren ongeveer 1,5 liter leidingwater met behulp van een commercieel dechlorinating middel (verkrijgbaar bij dierenwinkels) of door te laten water staan ​​voor 24 uur. Verkrijgen drie 1 L b…

Representative Results

Zoals geïllustreerd in figuur 1, kunnen vellen keratocyten opgemerkt migreren uit onder de omvang binnen uren van vaststelling van explantaatkweek. Af en toe kan een individueel migreren keratocyte die weg heeft gebroken van het collectief migreren plaat in acht worden genomen. Bovendien, als het explantaat werd vastgesteld uit een vis die eerder geplukt, zijn er overvloedige neutrofielen migreren door het vel. Bij periodes langer cultuur, de keratocyte vel fragmenten als cellen ondergaan EMT 14.<…

Discussion

De meest kritische stap voor het succes van keratocyte explantaatkweek is waardoor de schaal te houden aan de kweekschaal gedurende ongeveer 2-3 min vóór toevoeging van het kweekmedium. Ongeveer 75% van de schalen zal zich houden en te groeien vellen (het aantal vastgesteld voor elk experiment culturen zullen moeten worden aangepast). Keratocyte vellen geen deel om elke schaal verwijderd uit de vis en in cultuur om verschillende redenen. Eerst DAPI kleuring van explantaten blijkt dat sommige schalen weinig gehechte ce…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)	MatTek	P35GC-1.5-14-C	1.5 mm  thickness is best for coverslip removal.  14 mm diameter provides more culture area.
Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303	VWR	21909-460	We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.