使用同源物种抗体进行免疫组织化学与多重标记以研究成年海马神经发生

摘要

本视频文章展示了一种全面的实验方案，可在同一组织切片中检测并定量成年海马神经发生的各个阶段。我们改进了一种方法，以克服在无法获得来自不同宿主物种的合适抗体时，间接多重免疫荧光技术所存在的局限性。

摘要

成年神经发生是一个受到高度调控的多阶段过程，新的神经元由激活的神经干细胞通过一系列逐步定向分化的中间前体细胞亚型产生。这些前体细胞亚型各自表达一组特定的分子标记物，并结合特定的形态学标准，可用于其识别与鉴定。通常采用免疫荧光技术，结合亚型特异性抗体以及外源性或内源性增殖标记物进行检测。本文描述了用于检测和定量成年海马神经发生各阶段的免疫标记方法，包括胸腺嘧啶类似物的应用、经心脏灌注、组织处理、热诱导表位修复、ABC免疫组织化学、多重间接免疫荧光、共聚焦显微镜观察以及细胞定量分析。此外，我们还介绍了 一种连续多重免疫荧光染色方案，可避免因使用同一宿主物种来源的一抗而通常引发的问题。该方法能够在单个切片中同时精确定位所有海马区前体细胞亚型及增殖标志物。这些技术为并行研究不同前体细胞亚型的调控机制、其在脑部病理过程中的参与以及其在特定脑功能中的作用提供了强有力的工具。

引言

大脑中有两个区域在整个生命过程中持续产生新的神经元，分别是侧脑室的室下区和海马齿状回（DG）的颗粒下区（SGZ）。新生神经元起源于神经前体细胞，并经历多个形态学和生理学发育阶段后最终成熟^1,2。从缓慢分裂的放射状胶质样干细胞（1型）开始，依次产生一系列过渡性扩增的中间前体细胞。其中更未分化的亚型（2a型和2b型）形态不规则，具有较短的切向突起。这些细胞进一步生成神经母细胞（3型），后者逐渐退出细胞周期，转变为未成熟神经元（树突伸向分子层），最终作为成熟的颗粒细胞整合入海马神经网络。由于这些细胞具有特殊的生理特性，可为神经回路提供更强的可塑性³，提示其在海马功能中具有独特作用。事实上，过去十年的研究已积累大量证据表明，成年期神经发生参与空间记忆、模式分离以及情绪行为的调控^4,5。

成年神经发生可通过多种方法进行研究。胸苷类似物可在细胞周期S期掺入DNA，从而实现新生细胞的出生时间标记、定量分析及命运追踪^6-8。依次使用不同的胸苷类似物（例如，CldU、EdU或IdU）可用于研究细胞更替或在实验过程中不同时间点出生的细胞群体⁹。另一种内源性细胞增殖标记物是Ki67，它在细胞周期的所有分裂阶段（G1、S、G2、M）均有表达，但在静止期（G0）及G1早期除外 ^10,11。为了分析成年齿状回中新生细胞群体的表型，可使用多种阶段特....

方案

注意：所有涉及活体动物的操作均依照欧盟指令86/609/EEC关于实验动物护理与使用的指南进行，并经当地伦理委员会（Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz）批准。

1. 胸腺嘧啶类似物的腹腔注射

1. 在注射前一天称量动物体重。根据次日计划进行的所有注射，计算所需的胸苷类似物总量，并计算每只动物按体重调整后的注射体积（使用10 mg/ml的储备液）。
2. 配制10 mg/ml的胸苷储备液。（注意！ 胸苷类似物具有毒性。请遵循供应商提供的具体材料安全数据表（MSDS）要求，即 穿戴实验服和手套，在化学通风橱中操作）。
   1. 从冷冻保存条件下取出胸苷类似物，恢复至室温（约21 °C）。称取10 mg，加入无菌生理盐水（用于BrdU和CldU）或含0.04 N NaOH的无菌生理盐水（用于IdU），涡旋混匀。置于50 °C水浴中至少10 - 15分钟，每2 - 3分钟涡旋一次，以充分溶解粉末。
      注意：溶液在室温下可使用不超过24小时，在-20 °C下可保存数周。需避光保存（用铝箔包裹）。每次使用前应检查是否有沉淀，必要时重新溶解。
3. 抓住小鼠颈背部皮肤固定，使用带有30 G针头的精密注射器，在室温下经腹腔注射适当体积的储备液（....

结果

我们采用上述方法对出生后及成年海马体中的新生细胞进行定量与表征。因此，我们使用了野生型以及神经发生缺陷型的细胞周期蛋白D2基因敲除（Ccnd2KO) 小鼠，饲养条件已知会影响神经发生速率（即， 富集环境（enriched environment, EE）^13,14. 针对Ki67、BrdU、CldU或IdU的免疫组织化学DAB染色 consistently 显示了野生型与突变型之间新生细胞数量的差异 Ccnd2KO小鼠（图3)¹⁵此外，通过连续等摩尔浓度的CldU和IdU注射，我们能够区分在特定环境富集（EE）时期内生成的细胞群体图3C,D）。采用3.2.4节的方法，我们能够成功检测到在同时给予CldU和IdU后，两者信号强度相等且具有优异的重叠性。图4）。通过同时使用 BrdU 和 NeuN，可采用标准免疫荧光方法对 BrdU 标记的新生细胞进行表型鉴定（图5）或 BrdU、GFAP、nestin-GFP.......

讨论

新生细胞亚群的定量与鉴定是成体神经发生研究中的核心问题。通过结合增殖标记物和针对成体神经发生特定阶段表达蛋白的抗体，可对这些亚群进行免疫组织化学检测。某些抗体或抗体组合需要特定的染色条件。

使用合成胸腺嘧啶类似物标记分裂细胞仍是研究成年海马神经发生的金标准。在实验开始前，必须考虑合适的注射方案。我们通常以50 mg/kg（体重，腹腔注射）的剂量给予BrdU，但具体浓度可根据实验需求进行调整（单次注射剂量可高达300 mg/kg）^8,16。若需依次注射IdU和CldU以实现细胞群体的时间分辨，则必须使用等摩尔浓度（例如，42.5 mg/kg CldU 和 57.5 mg/kg IdU）。需要注意的是，胸腺嘧啶类似物可能对分裂细胞具有毒性，还可能标记正在进行DNA合成的受损细胞¹⁶。另一个缺点是，胸腺嘧啶类似物的免疫组织化学检测需要进行DNA变性处理，这可能会干扰抗体的抗原性或其他DNA标记技术（例如，DAPI、Hoechst 33258）。检测内源性增殖标志物（如Ki67）的免疫组织化学方法可能是一种合适.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胸苷类似物给药
5-溴-2′-脱氧尿苷，BrdU	Sigma-Aldrich	B9285	有毒（致突变性，致畸性）
5-氯-2′-脱氧尿苷，CldU	Sigma-Aldrich	C6891	有毒（致突变性，致畸性）
5-氯-2′-脱氧尿苷，CldU	MP Biomedicals	2105478	有毒（致突变性，致畸性）
5-碘-2′-脱氧尿苷，IdU	MP Biomedicals	2100357	有毒（致突变性，致畸性）
组织制备
异氟烷-Actavis	Piramal Healthcare	700211
多聚甲醛粉末（PFA）	Riedel-De Häen	16005	有毒，易燃
灌注泵 PD5206	Heidolph Instruments	523-52060-00
Masterflex Tygon 实验室管路，Ø 0.8 mm	Thermo Fischer Scientific	06409-13
饲喂针头，直型，21 G，1.75 mm 橄榄尖，40 mm	Agnthos	1036
冷冻切片机 Microm HM 400	Thermo Fischer Scientific
24孔细胞培养板	Greiner Bio-One	662160
免疫组织化学
Tefal vitacuisine 蒸汽炉	Tefal	VS 4001
Netwell 24 mm 聚酯网膜插件	Corning	3479	预装于6孔培养板中
Netwell 15 mm 聚酯网膜插件	Corning	3477	预装于12孔培养板中
Netwell 塑料6孔支架套件	Corning	3521	用于24 mm 聚酯网膜插件
Netwell 塑料12孔支架套件	Corning	3520	用于15 mm 聚酯网膜插件
Vectastain Elite ABC 试剂盒	Vector Laboratories	PK-6100
DAB（3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐水合物）	Sigma-Aldrich	D-5637	致癌性，光敏感
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
一抗
兔 IgG1 α-Ki67	Novocastra/ Leica Biosystems	NCL-L-Ki67MM1	DAB 1:400/IF 1:100；需抗原修复
兔 α-GFAP，AS-3-GF	Synaptic Systems	173 002	1:500
山羊 IgG (H+L) α-GFP	Acris Antibodies	R1091P	1:300
小鼠 IgG1 α-巢蛋白（nestin）	Abcam	ab6142	1:200；需抗原修复
豚鼠 IgG (H+L) α-双皮质素（Doublecortin）	Merck Millipore	AB2253	1:500
大鼠 IgG2a α-BrdU（腹水）	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030CX	用于BrdU检测；DAB 1:500/IF 1:400
大鼠 IgG2a α-BrdU（纯化）	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030	用于CldU检测；DAB 1:500/IF 1:250-400
小鼠 IgG1 α-NeuN	Merck Millipore	MAB377	1:500
小鼠 IgG1κ α-BrdU	BD Biosciences	347580	用于IdU检测；DAB 1:500/IF 1:350
二抗
驴 α-豚鼠 IgG (H+L)-生物素	Dianova	711-065-152	1:500
驴 α-大鼠 IgG (H+L)-生物素	Dianova	712-065-150	1:500
驴 α-小鼠 IgG (H+L)-生物素	Dianova	715-065-151	1:500
山羊 α-大鼠 IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11006	1:250
驴 α-山羊 IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11055	1:250
驴 α-小鼠 IgG (H+L)-FITC，Fab片段	Dianova	715-097-003	1:100
驴 α-小鼠 IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	715-605-151	1:250
驴 α-豚鼠 IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	706-605-148	1:250
驴 α-大鼠 IgG (H+L)-罗丹明红-X	Dianova	712-295-150	1:250
驴 α-兔 IgG (H+L)-罗丹明红-X	Dianova	711-295-152	1:250
驴 α-豚鼠 IgG (H+L)-罗丹明红-X	Dianova	706-296-148	1:250
链霉亲和素-罗丹明红-X	Dianova	016-290-084	1:500
山羊 α-兔 IgG (H+L)-AMCA	Dianova	111-155-144	1:250，仅适用于兔 α-GFAP
Hoechst 33342	Molecular Probes	H3570	1:1000
DAPI	Molecular Probes	D1306	1:1000
封闭
Fab片段 驴 α-小鼠 IgG (H+L)	Dianova	715-007-003	1:20
Fab片段 驴 α-兔 IgG (H+L)	Dianova	711-007-003	1:20
正常驴血清	Merck Millipore	S30
正常兔血清	Dianova	011-000-010
正常山羊血清	Dianova	005-000-001
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906
组织学
焦油紫（Cresyl violet）	Sigma-Aldrich	C5042
Neo-Clear	Merck Millipore	109843	无毒二甲苯替代品
Neo-Mount	Merck Millipore	109016	永久封片剂
显微镜
Axioskop 2	Carl Zeiss Microscopy
LSM 710	Carl Zeiss Microscopy