Gold-Nanostäbchenunterstützte optische Stimulation von Nervenzellen
Summary
This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.
Abstract
Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.
Introduction
Jüngste Studien haben gezeigt, daß die Übergangserwärmung mit der Absorption von Infrarotlicht durch Wasser (Wellenlänge> 1.400 nm) verbunden sind, können verwendet werden, um Aktionspotentiale in Nervengewebe 1 und intrazellulären Calciumtransienten in Kardiomyozyten 2 induzieren. Die Verwendung von Infrarotlicht hat großes Interesse für Anwendungen in der Neuroprothesen angehoben, aufgrund der potentiellen feinere räumliche Auflösung, Fehlen eines direkten Kontaktes mit dem Gewebe, Minimierung der Stimulationsartefakte und das Entfernen der Notwendigkeit, genetisch die Zellen vor der Stimulation verändern ( wie in Optogenetik erforderlich) 1. Trotz all dieser Vorteile, schlug kürzlich entwickelte thermische Modelle, dass die Zielgewebe / Zellen können durch kumulative Wärmeeffekte, wenn mehrere Konjunktur Websites und / oder hohen Repetitionsraten verwendet 3,4 berührt.
Als Antwort auf diese Herausforderungen haben die Forscher das Potenzial, extrinsische absor zugelassenesglieder zur Nervenstimulation, mehr lokalisierte Erwärmungseffekte im Gewebe zu produzieren. Huang et al. Gezeigt, dieses Prinzip durch Verwendung superpara Ferritnanopartikel die temperaturempfindliche TRPV1 Kanäle in HEK 293 Zellen, die mit einem Hochfrequenz-Magnetfeld 5 Ferne zu aktivieren. Obwohl diese Technik für ein tieferes Eindringen zu ermöglichen (Magnetfelder in Wechselwirkung relativ schwach mit Gewebe) wurden die Reaktionen nur über einen Zeitraum von Sekunden aufgezeichnet, anstatt Millisekundendauer in bionische Vorrichtungen 5 erforderlich. Ähnlich Farah et al. Zeigten elektrische Stimulation kortikale Neuronen der Ratte mit schwarzen Mikropartikel in vitro. Sie zeigten zellgenau in Stimulation mit Pulsdauern in der Größenordnung von Hunderten von & mgr; s und Energien im Bereich von & mgr; J, potenziell ermöglicht eine schnellere Wiederholraten 6.
Die Verwendung von extrinsischen Absorber wurde auch angewendet, um zu induzierenmorphologische Veränderungen in vitro. Ciofani et al. Zeigten eine Zunahme ~ 40% in neuronalen Zell Auswuchs mit piezoelektrischen Bornitrid-Nanoröhren durch Ultraschall 7 erregt. Ähnlich endozytosiert Eisenoxidnanopartikel in PC12-Zellen wurde berichtet, Neuriten Differenzierung in einer dosisabhängigen Art und Weise zu erweitern, die durch die Aktivierung von Zelladhäsionsmolekülen mit dem Eisenoxid 8.
Vor kurzem hat das Interesse an der äußeren Absorber auf neuronale Stimulation unterstützen auch die Verwendung von Gold-Nanopartikeln (Au-NPs) konzentriert. Gold-Nanopartikel haben die Fähigkeit, Laserlicht effizient absorbieren an der Plasmonen Spitze und sie in die Umgebung in Form von Wärme 9 zerstreuen. Unter allen verfügbaren Partikelformen, die optische Absorption des Gold-Nanostäbchen (Au NRs) bequem passt das therapeutische Fenster von biologischen Geweben (Nahinfrarot – NIR- Wellenlänge zwischen 750-1,400 nm) 10. Darüber hinaus wird in der Fortsetzungext neuronaler Stimulation, die Verwendung von Au NRs bietet relativ günstige Biokompatibilität und eine breite Palette von Oberflächenfunktionalisierung Optionen 11. Jüngste Studien haben gezeigt, dass eine stimulierende Wirkung auf die Differenzierung nach der kontinuierlichen Laserbelichtungen Au NRs in NG108-15 neuronalen Zellen 12 induziert werden. In ähnlicher Weise wurden die intrazelluläre Calcium Transienten in neuronalen Zellen mit Au NRs nach der Laserbestrahlung mit variablen Frequenzen und impulsmoduliert Weiten 13 kultiviert aufgezeichnet. Zellmembran Depolarisation wurde auch nach NIR Laserbeleuchtung Au NRs in primären Kulturen von Spiralganglienneuronen 14 aufgezeichnet. Die erste in vivo-Anwendung mit bestrahlten Au NRs wurde erst kürzlich unter Beweis gestellt. EOM und Mitarbeiter ausgesetzt Au NRs an deren Plasmonenspitze und erfasst eine sechsfache Erhöhung in der Amplitude der Verbindung Nervenaktionspotentiale (Cnaps) und eine dreifache Verringerung der Reizschwelle in Rattenischiasnerven. Die enhanced Reaktion wurde die lokale Erwärmungseffekte von der Erregung des NR plasmonic Peak 15 resultierende zurückzuführen.
In der vorliegenden Arbeit werden die Protokolle für die Untersuchung der Auswirkungen von Laserstimulation in NG108-15 neuronalen Zellen mit Au NRs kultiviert angegeben. Diese Methoden bieten eine einfache, aber leistungsstarke Möglichkeit, Zellpopulationen in vitro Bestrahlung mit Standard-biologischen Techniken und Materialien. Das Protokoll basiert auf einem fasergekoppelten Laserdiode (LD), der einen sicheren Betrieb und reproduzierbare Ausrichtung ermöglicht. Die Au-NR Probenvorbereitung und Laserbestrahlungsverfahren kann weiter auf verschiedene Partikelformen und neuronalen Zellkulturen ausgedehnt werden, vorausgesetzt, dass die gezielte Synthese und Kultur Protokolle bekannt sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in dieser Präsentation beschriebenen Protokolle beschreiben, wie Kultur, zu differenzieren und optisch zu stimulieren Nervenzellen mit extrinsischen Absorber. Die NR Eigenschaften (zB Abmessungen, die Form, Plasmonresonanzwellenlänge und die Oberflächenchemie) und die Laserstimulationsparameter (wie zum Beispiel Wellenlänge, Impulsdauer, Wiederholungsrate usw.) können variiert werden, um verschiedene experimentelle Bedürfnisse angepasst werden. Die Auswirkungen auf das Zellverhalten können m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten NanoVentures Australien Reise finanzielle Unterstützung und Prof. John Haycock, dass sie diese Forschung an der University of Sheffield und Frau Jaimee Mayne teilweise gehostet für ihre Hilfe bei den Dreharbeiten zu bestätigen.
Materials
| Au NR | Sigma Aldrich | 716812 | |
| NG108-15 | Sigma Aldrich | 8811230 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6546 | |
| FCS | Life Technologies | 10100147 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290018 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Triton X-100 | BDH | T8532 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2058 | |
| Anti-βIII-tubulin | Promega | G7121 | |
| TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody | Sigma Aldrich | T5393 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| Equipment name | Company | Catalogue Number | |
| UV-Vis spectrometer | Varian Medical Systems Inc. | Cary 50 Bio | |
| Mini centrifuge | Eppendorf | Mini Spin | |
| Sonic bath | Unisonics Australia | FPX 10D | |
| Cell culture incubator | Kendro | Hera Cell 150 | |
| Cell culture centrifuge | Hettich | Rotofix 32A | |
| Laser diode | Optotech | 780 nm single mode fibre – coupled LD | |
| Optical fiber | Thorlabs | 780 HP | |
| Power meter | Coherent | Laser Check | |
| ImageJ | http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html | ||
| Epifluorescent microscope | Axon Instruments | ImageX-press 5000A | |
| μ-slide well | Ibidi | 80826 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy Ltd. | LSM 510 meta-confocal microscope | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS210 |
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