Protokolle für die Beschaffung Zygotic und somatischen Embryonen zur Untersuchung der Regulation der frühen Embryo-Entwicklung in der Modell-Hülsenfrucht<em> Medicago truncatula</em
Summary
The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.
Abstract
Der frühen Embryogenese ausgehend von einer einzigen Zelle Zygote geht durch schnelle Zellteilung und Morphogenese und ist morphologisch durch pre-kugelförmig, kugelförmig, Herz, Torpedo und Keimblattstufen gekennzeichnet. Diese fortschreitende Entwicklung ist unter der strengen Regelung einer komplexen molekularen Netzwerk. Ernte ausreichend frühen Embryonen in einem ähnlichen Entwicklungsstufe ist für die Untersuchung der zellulären und molekularen Regulation der frühen Embryogenese. Das ist nicht einfach, da der frühen Embryogenese erfährt rasche Morphogenese in kurzer Zeit zB 8 Tage Medicago truncatula die frühen Keimblattstadium zu erreichen. Hier wenden wir uns das Problem durch zwei Ansätze. Die erste stellt eine Verbindung zwischen der Embryonalentwicklung und pod Morphologie helfen zeigen die Stufe des zygotischen Embryos. Dies ist insbesondere auf die Anzahl der Spiralen und pod Entwicklung der Stacheln beruht. Ein alternativer Weg zur Ergänzung des in vivo sTUDIEN ist über Kultivierung Blattexplantate zu somatischen Embryonen zu produzieren. Das Medium enthält eine ungewöhnliche Hormonkombination – ein Auxin (1-Naphthalinessigsäure), ein Cytokinin (6-Benzylaminopurin), Abscisinsäure und Gibberellinsäure. Die verschiedenen Phasen erkennbar wachsen aus dem Kallus ohne Dissektion werden.
Introduction
Hülsenfrüchte sind die drittgrößte Gruppe von höheren Pflanzen mit ca. 20.000 Arten und der (oder Fabaceae) Familie Leguminosae sind einmalig Getreide in Gebiet geerntet und Gesamtproduktion 1. Sojabohne ist die drittgrößte Kulturpflanzen. Hülsenfrüchte liefern etwa ein Drittel des Nahrungsprotein und ein Drittel von Pflanzenöl für den menschlichen Verzehr 2. Hülsenfrüchte mit Fixierfähigkeit N 2 auch dazu beitragen, eine nachhaltige landwirtschaftliche Systeme. Medicago truncatula, wie Sojabohne, speichert Protein und Öl in den Kotyledonen der Samen und ist eine genetische und genomische Leguminosen Modell mit erheblichen genetischen und genomischen Ressourcen 3,4. Während M. truncatula hat Fortschritte im Verständnis der Leguminosen-Rhizobien Symbiose 4 hat es zunehmend eingesetzt, um Hülsenfruchtsamen Biologie 5-7 und Embryogenese 8,9 studieren aktiviert. Arabidopsis Embryogenese wurde intensiv untersucht, aber es 10,11 isa Nichthülsenfrucht und die Details der Embryogenese sind nicht identisch mit Medicago 8,10. Zygotischen Embryogenese in M. truncatula hat interessante Features, mit einem unverwechselbaren vielzelligen Hypophyse, einer endoployploid suspensor und basalen Übertragungszelle 8.
Somatische Embryogenese (SE) wird üblicherweise zur Regeneration von Pflanzen 12 eingesetzt. In der Hülsenfrüchte Modell M. truncatula das Saatgut Linie Jemalong 2HA (2HA) wurde aus der Mutter Jemalong entwickelt worden, um hohe somatische Embryo 13 haben. Die Zahl der Embryonen hergestellt wurde kürzlich inhaltlich, indem sowohl die Gibberellinsäure (GA) und Abscisinsäure (ABA) in die seit langem etablierte Medium 14 erhöht. In diesem Fall GA und ABA wirken synergistisch, was ungewöhnlich ist da GA und ABA in der Regel 14 antagonistisch wirken. Die aus Kallus produziert Embryonen entwickeln sich auf der Oberfläche, die das Stadium der Embryogenese, leicht bestimmt werden können Visually und leicht geerntet. Mit in der Nähe von isogenen Linien, die embryo (2HA) und nicht-embryo (Jemalong) sind erleichtert die Untersuchung der somatischen Embryogenese und sowohl in vivo und in vitro-Systemen bietet verschiedene Experimentiermöglichkeiten.
Das Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen der Embryoentwicklung ist wesentlich für das Verständnis Saatgut und Pflanzenentwicklung. In Hülsenfrüchten, wie in anderen Dikotyle ist es die Cotyledonen des Embryos, die die Produkte, die für die menschliche Ernährung verwendet werden, zu speichern. Der frühen Embryogenese beinhaltet schnelle Zellteilung und korrekte Embryo Musterung. In ca. 8 Tage nach der Befruchtung, der M. truncatula Embryo erreicht frühen Keimblattstufen. Die morphologischen Charakterisierung ist nicht genau durch Tage nach der Befruchtung in Gewächshausbedingungen angedeutet. Somit ist eine effiziente Standardansatz, um die Phase der sich entwickelnden Embryonen zeigen wertvoll bei der Untersuchung der genetischen regulation der frühen Embryogenese zygotische.
In diesem Beitrag stellen wir zwei standardisierte Protokolle, um sich entwickelnden Embryonen für biologische Untersuchungen der Embryogenese in der Hülsenfrüchte Modell M. sammeln truncatula. Die erste ist zu zygotischen Embryos durch Zuordnung der Embryogenese und pod Morphologie während der zweite ist die somatische Embryogenese via Kultivierung Blattexplantate zu leicht zugänglich großen Embryo Zahlen liefern zu sammeln.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die beschriebenen Protokolle sind relativ einfach und ermöglicht Untersuchung der Leguminosen Embryogenese mit allen modernen Zell- und molekulare Techniken. Wir erkennen, dass es Vorteile und Nachteile sowohl in vivo und in vitro-Ansätze. Beide erlauben mehr Fokus auf der frühen Embryogenese im Vergleich zu Kultur der unreifen Samen 19.
Im Fall von in vivo-Studien, was beschrieben wird vorwiegend die Isolierung der Samenanlage von dem POD passend fü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.
Materials
| P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
| Major salts | |||
| Minor salts | |||
| Vitamins | |||
| Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
| Plant hormones | |||
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
| Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
| Equipment | |||
| Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
| Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
| Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
| Sterilising leaves | |||
| 250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |
References
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