Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado
Summary
Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.
Abstract
Analizando las respuestas fisiológicas de las neuronas sensoriales olfativas (OSN) cuando son estimuladas con ligandos específicos es fundamental para entender la base de comportamientos-olfativas impulsada y su modulación. Estas propiedades de codificación dependen en gran medida de la interacción inicial entre las moléculas de olor y el receptor olfatorio (OR) expresados en las OSN. El espectro de la identidad, la especificidad y el ligando de la O expresado son críticos. La probabilidad de encontrar el ligando de la O expresado en una OSN elegido al azar dentro del epitelio es muy baja. Para hacer frente a este reto, este protocolo utiliza genéticamente ratones etiquetados que expresan la proteína fluorescente GFP bajo el control del promotor de RUP definidos. OSNs se encuentran en un epitelio apretado y organizada que recubre la cavidad nasal, con las células vecinas influir en su maduración y función. Aquí se describe un método para aislar un epitelio olfatorio intacto y grabar a través de patch-clamp grabaciones las propiedades de OSN correoXpressing receptores de olor definidas. El protocolo permite que uno para caracterizar propiedades de la membrana OSN mientras se mantiene la influencia del tejido vecino. Análisis de los resultados de patch-clamp produce una cuantificación precisa de ligando / O interacciones, las vías de transducción y la farmacología, las propiedades de codificación OSN y de su modulación a nivel de la membrana.
Introduction
Las neuronas sensoriales olfativas (OSN) representan el primer paso de la percepción olfativa. Situado en el epitelio olfativo que recubre la cavidad nasal en roedores, transforman la información química de los odorantes en los potenciales de acción se ha enviado a través de su axón al cerebro. Para entender mejor los mecanismos de codificación olfativas, es necesario para caracterizar las propiedades de transducción y de membrana de OSN. Hasta hace poco, la mayoría de las técnicas utilizadas para caracterizar las propiedades de OSN mamíferos se llevaron a cabo en disociado OSN 1-4. El proceso de disociación utiliza varios (es decir, enzimas) procesos mecánicos y químicos para liberar a los OSNs de su entorno. Estos procesos provocan un bajo número de células disponibles para las grabaciones. Este número bajo puede ser aún más crítico en el caso de células GFP marcado. La disociación también elimina los locales interacciones célula a célula entre OSN y otras células del epitelio olfativo que pueden mejorar survivcol y la modulación de las propiedades OSN. Con el fin de eludir el procedimiento de disociación, una preparación intacta fue desarrollado 5.
Cada OSN expresa un receptor olfativo (OR) seleccionado de una gran familia multigénica 6. Hay ~ 1000 RUP expresadas en el epitelio olfativo principal en el ratón. Debido a la gran cantidad de O en los animales de tipo salvaje, las posibilidades para grabar OSN que expresan el mismo o son muy bajas. Para superar estas limitaciones, los ratones de genes dirigidos están disponibles en el que todos OSN expresan un identificadas o están etiquetados con una proteína fluorescente 7-9. Estos OSN marcadas se usan para hacer el análisis funcional en preparaciones disociadas 7,10,11 con los inconvenientes mencionados anteriormente. Una preparación epitelio intacto 5 de ratones genéticamente etiquetados por lo tanto, evita estos problemas. Permite el seguimiento de la actividad de OSN expresando RUP definidas con precisión en un entorno tan cerca en vivo posible. Además, patch-clamp grabaciones de OSN también permiten un análisis preciso de las propiedades de membrana, vía de transducción de la farmacología, ligando / O interacciones. Todos estos temas casi no se pueden analizar usando grabaciones extracelulares. Se utilizó esta técnica para controlar las respuestas de OSN que expresan los receptores de olor SR1 y MOR23 12,13. La viabilidad de la técnica fue confirmado por otros grupos en MOR23 expresan OSN 14, así como en otras regiones ultraperiféricas que expresan neuronas 15,16. El seguimiento de una población definida de OSN puede conducir al análisis de sus propiedades en muchos contextos diferentes, tales como el desarrollo 14, el envejecimiento 17, plasticidad inducida odorante 18, y el papel de las variaciones en la secuencia del receptor de odorizantes de olor en la codificación de 15. Así, este protocolo proporciona una poderosa herramienta para controlar las propiedades funcionales de OSN definidos a nivel de la membrana.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacidad de este protocolo para controlar correctamente las propiedades de OSN saludables depende en gran medida de la calidad de la preparación. Por lo tanto, los pasos de disección son críticos. En primer lugar, es crítico que prestar atención a la calidad (pH, osmolaridad), la oxigenación y la temperatura del medio de disección (pero no congelado enfriado con hielo). En segundo lugar, la manipulación del epitelio con herramientas de disección debe ser tan limitado como sea posible para evitar daños. Por…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Peter Mombaerts for the generous gift of OR-GFP mice; Anne Lefranc and the CSGA animal facility for excellent animal care. Funding was provided by CNRS through an ATIP and ATIP Plus grants, by Conseil Régional de Bourgogne (FABER and PARI grants), by Université de Bourgogne (BQR program).
Materials
| heavy equipment | |||
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4x or 10x for coarse approach to the cell; and a 40x immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW/IR/0,8/WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| recording electrodes /system | |||
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/1Oth of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | warner instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride di hydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| MethylSulfoxide | Sigma-Aldrich | 47,135-6 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
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