Sistemi HeLa cellule base libera espressione a manifestare<em> Plasmodium</em> Rhoptry Proteine
Summary
Espressione di proteine della malaria nei sistemi basati su celle rimane difficile. Dimostriamo due sistemi di cella di espressione libera di passo e un passo IVT (nella traduzione vitro) per l'espressione di proteine della malaria rhoptry ricombinanti da cellule HeLa. Usiamo un sistema di purificazione a base Ni-resina di affinità per purificare le proteine rhoptry.
Abstract
La malaria causa una significativa morbilità e mortalità globale. Nessun vaccino di routine è attualmente disponibile. Uno dei motivi principali per la mancanza di un vaccino è la sfida di identificare idonei vaccini candidati. Proteine malariche espressi utilizzando sistemi di espressione cellulari basati procariote ed eucariote sono scarsamente glicosilate, generalmente insolubile e sottoposti pieghevole improprio con conseguente riduzione della immunogenicità. I sistemi di espressione libere di germe di grano, reticolociti di coniglio lisato ed Escherichia coli lisato sono attualmente utilizzati per l'espressione di proteine della malaria. Tuttavia, la lunghezza del tempo di espressione e glicosilazione impropria di proteine rimane ancora una sfida. Dimostriamo espressione di proteine Plasmodium in vitro utilizzando sistemi di espressione libera cellulari basato HeLa, denominati "sistemi in vitro di cellule umane libera espressione". I sistemi di espressione cell free basato 2 HeLa trascrivere mRNA in 75 minuti e 3 ml di transcribed mRNA è sufficiente la traduzione proteine in 90 min. Il sistema di espressione 1-passo è una trascrizione e traduzione sistema di espressione accoppiato; la trascrizione e co-traslazione avviene in 3 ore. Il processo può anche essere esteso per 6 ore fornendo energia supplementare. Nel sistema di espressione 2-passo, viene prima mRNA trascritto e quindi aggiunto alla miscela di traduzione per l'espressione della proteina. Descriviamo come esprimere le proteine della malaria; una idrofobica Cleft di PF3D7_0114100 Maurer – 2 transmembrana (PFMC-2TM) di proteine, una proteina PF3D7_0925900 idrofila e un armadillo ripete contenenti proteine PF3D7_1361800, utilizzando il sistema di espressione delle cellule HeLa base. Le proteine sono espresse nelle micro volumi impiegando strategie di espressione 2-step e 1-step. Un metodo di purificazione di affinità per purificare 25 ml di proteine espresse utilizzando il sistema di libera espressione in vitro delle cellule umane è anche descritto. Resa di proteine è determinato mediante saggio di Bradford e l'espressoe proteine purificate possono essere confermati da analisi di western blotting. Proteine ricombinanti espresse possono essere utilizzati per vaccinazioni, test immunologici e proteine sequenziamento.
Introduction
Nella ricerca la malaria, l'espressione delle proteine immunogeniche utilizzano sistemi basati cellula procariote o eucariote rimane una sfida. La ricchezza AT del genoma Plasmodium e sconosciute meccanismi posta traslazionali 14,7, contribuiscono alle difficoltà connesse con l'ottenimento di proteine correttamente giunte e immunogenico per gli studi di produzione di anticorpi e vaccini. Sistemi procariotici quali Escherichia coli sono stati utilizzati per l'espressione della proteina ricombinante. Sistemi procariotiche sono a basso costo, efficace, producono alte rese di proteina ricombinante e hanno più vettori di clonazione. Host E. coli sono facili da trasformare e cellule crescono rapidamente. Tuttavia, i sistemi procarioti hanno delle limitazioni come la mancanza di sostituzione aminoacidica, modificazione post-traslazionale, rischio di contaminazione, prodotti eterogenei e l'accumulo di proteine ricombinanti in corpi di inclusione 24.
In unstudio di Mehlin et al. (2006), sono stati espressi 1000 fotogrammi di lettura aperta (ORF). Circa il 7% delle proteine espresse erano solubile 14. L'insolubilità osservata è dovuta alla natura di parte dei geni e l'alta frequenza di codoni che sono idealmente utilizzato dal Plasmodium AT ricca genoma 14. Una strategia alternativa per superare questo problema è stato sviluppato usando plasmidi o cellule ospiti contenenti tRNA che riconoscono codoni rare o codoni che corrispondono alle frequenze 3. Anche dopo l'esecuzione di queste ottimizzazioni, molto piccole porzioni di proteine sono espresse come solubili, attiva e immunogenico 14. I sistemi di espressione cell-free contengono tutti i componenti necessari per la trascrizione e la traduzione, come ribosomi, fattori di inizio, fattori di allungamento (fattori traduzioni), tRNA e aminoacil-tRNA sintetasi. Entrambe le reazioni di trascrizione e traduzione sono accoppiati in procedimento a passo 11,29. Il transcrireazione ption viene eseguita in un tubo prima quantità appropriata di mRNA viene incubato con macchinari traduzione in un'altra 11,29 tubo. Sebbene questi metodi sono efficaci nel Plasmodium sp. Espressione della proteina, un grave inconveniente è la lunghezza di tempo per l'espressione della proteina, che è di circa 22 ore 29. Inoltre, l'alto costo delle forniture per l'inclusione nei protocolli 29, i preparativi alta intensità di lavoro del lisato cellulare e incongruenze nelle preparazioni dei componenti, rendono questi sistemi irraggiungibile. L'obiettivo principale dei ricercatori per lo sviluppo di un sistema di libera espressione delle cellule dipende da fattori come la modificazione genetica rapida, rese veloci con alte concentrazioni e diritte preparati lisato avanti 1.
Sistemi eucarioti come il lievito, linee cellulari di mammiferi, baculovirus sistema di espressione mediata, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum e sistemi di espressione parassitarie such come Leishmania sono stati utilizzati per l'espressione della proteina ricombinante 7. Sistemi eucarioti condividono relazione filogenetica e quindi condividono anche caratteristiche come la glicosilazione, acilazione, formazione di legami disolfuro, interazione chaperone, proteolisi e compartimentalizzazione sub-cellulare. Proteine eventi secrezione in eucarioti prevengono l'accumulo e diminuisce la tossicità per sistemi di espressione 13. L'uso di sistemi di lievito è preferito come sono adatti per l'espressione di proteine in larga scala e per ottenere alte rese 4. Due P. falciparum proteine PFCP-29 e Pvs25 sono state prodotte utilizzando il sistema di lievito 4. Tuttavia, un grave inconveniente nella sintesi della maggior parte delle proteine era N e O-glicosilazione pattern irregolari, pieghevole improprio e troncamento di proteine dalla loro forma nativa 4.
L'uso di cellule di mammifero per la sintesi delle proteine ricombinanti è laboriosa ed è expenSIVE di mantenere stabili linee cellulari ricombinanti 4. Pertanto, le cellule di mammifero sono stati limitati per l'analisi di proteine di segnalazione, interazioni proteina e interazioni parassita-ospite e anche per testare vaccini DNA 4. Il DNA umano e in vitro sistema privo di cellule mRNA in espressione della proteina qui descritto è un sistema basato su mammiferi HeLa derivato dalle cellule che esprime proteine in 3 ore. Proteine espresse utilizzando pT7CFE1-Chis vettore di espressione hanno un tag C-terminale facilitare l'identificazione e la purificazione. Il sistema basato HeLa è completato con i fattori di inizio della traduzione e un regolatore di traduzione, migliorando così l'efficienza del sistema di traduzione. Le proteine possono essere rapidamente tradotti, vagliati, verificati ed elaborati per l'utilizzo in diverse applicazioni immunologici e strutturali 15.
Sistemi di espressione senza cellule eucariotiche come germe di grano e reticolociti di coniglio sono attualmente utilizzati per l'espressione di varproteine eucariotiche ious compreso Plasmodium proteine 11,29. Inoltre, E. sistemi acellulari basate coli sono anche impiegati per l'espressione della proteina eucariotica 11. Tabella 1 riassume diversi sistemi di espressione di cellule libera confrontando caratteristiche dei sistemi, nonché la facilità di utilizzo dei sistemi per l'espressione della proteina. Il sistema privo di cellule umane in confronto agli altri ha la capacità di eseguire postali e co-traslazionale modificazioni ed è meno costoso. Ottimizzazione Codon è possibile e tutte le reazioni possono essere eseguite in 3 ore. Il sistema HeLa è un sistema di traduzione ideale per la sintesi proteica in ambiente di laboratorio.
Uno dei principali vantaggi di sistemi di espressione di cellule umane libera rispetto ad altri sistemi cell free è la disponibilità di diverse linee cellulari derivate da diversi diversi organi e tessuti. Diverse varietà di sistemi liberi di cellule possono essere progettati in funzione della linea cellulare. L'estrattos derivate dalle cellule dei mammiferi hanno una maggiore efficienza di sintetizzare proteine di grandi dimensioni di tutti gli altri sistemi di espressione delle cellule gratuito. Questi sistemi cella libera espressione possono essere utilizzate anche in applicazioni diagnostiche e caratterizzazione di proteine come microarray 30. Le linee popolari cellule HeLa sono più ampiamente utilizzati per effettuare l'espressione di proteine 33. Il reticolo endoplasmatico in linee cellulari HeLa è sottosviluppati, portando alla mancanza di attività di modifica glicosilazione post-traduzionale 33. Tuttavia, questo sistema è ritenuto vantaggioso per Plasmodium sintesi proteica come Plasmodium manca anche traduzione modifica glicosilazione alberino 29. La libera protocollo di trascrizione-traduzione cellule HeLa è facile da eseguire, poco costoso e proteine può essere espresso in 90 min, pronta per la purificazione e altre applicazioni a valle.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passi per una proficua espressione di proteine utilizzando due fasi in vitro sistema libera espressione delle cellule umane e di purificazione sono: 1) l'amplificazione di successo e clonazione di geni nelle pT7CFE-Chis plasmide vettore; 2) la trascrizione di RNA a 30 ° C; 3) definizione di proteina a 30 ° C in presenza di inibitore RNAse; 4) lo sviluppo del protocollo di purificazione di affinità based utilizzando perle di resina rivestiti con Ni e 5) analizzare i risultati in Western Blot uti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.
Materials
| Two-step in vitro human cell free expression system | Thermo fischer | 88856 | Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| One-step in vitro coupled translation system | Thermo fischer | 88860 | Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| ProBond Purification system | Invitrogen | K850-01 | Store at room temperature |
| Probond Nickel-Chelating Resin | Invitrogen | R801-01 | Store at 4oC. |
| A+ Human Blood | Interstate Blood Bank | Store at 4oC. |
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