Гепатоцитов конкретных абляция в данио рерио по изучению желчных приводом печени Регенерация
Summary
To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.
Abstract
Печень имеет большой потенциал к регенерации. Гепатоциты, паренхиматозные клетки печени, могут регенерировать в одном из двух способов: или hepatocyte- желчных приводом регенерации печени. В гепатоцитов приводом регенерации печени, регенерирующие гепатоциты получены из уже существующих гепатоцитов, тогда как в желчных приводом регенерации, регенерирующие гепатоциты получены из желчных эпителиальных клеток (БЭК). Для гепатоцитов приводом регенерации печени, есть отличные модели на грызунах, которые внесли значительный вклад в современном понимании регенерации печени. Однако такой модели грызунов не существует для желчных приводом регенерации печени. Мы недавно сообщили о данио модели повреждения печени, в которой БЭК широко породить гепатоцитов По тяжелой потерей гепатоцитов. В этой модели, гепатоциты специально удалена с помощью фармакогенетических средств. Здесь мы представляем подробно методы абляции гепатоциты и проанализировать БЭК-приводом процесс регенерации печени.Это гепатоцитов конкретных абляция модель может быть дополнительно использованы, чтобы обнаружить основные молекулярные и клеточные механизмы желчных приводом регенерации печени. Кроме того, эти методы могут быть применены к химическим экранов, чтобы определить небольшие молекулы, которые увеличивают или подавляют регенерацию печени.
Introduction
Печень является высоко регенеративного органом. Во время регенерации печени, регенерации гепатоцитов, паренхиматозные клетки печени, получены из уже существующих гепатоцитов (гепатоцитов приводом регенерации печени) или (БЭК желчных приводом регенерации печени) 1,2. Травмы печени, как правило, вызывает пролиферацию уже существующих гепатоцитов; Однако, когда пролиферации гепатоцитов под угрозу, БЭК может способствовать гепатоцитов 2-4. Эти два способа регенерации печени являются клинически значимыми. По хирургического удаления части печени человека (например, из опухолей печени или живых доноров печени), гепатоциты в оставшейся печени размножаться, чтобы восстановить утраченную массу печени. В отличие от этого, у пациентов с тяжелыми заболеваниями печени, пролиферации гепатоцитов в значительной степени нарушена, так что БЭК или клетки-предшественники печени (LPCS) по всей видимости, способствуют регенерации гепатоцитов 5,6. Грызунов 2/3 частичная резекция печени модель, в которойгепатоциты размножаться, чтобы восстановить утраченную массу печени, внес значительный вклад в современное понимание гепатоцитов приводом регенерации печени 7,8. Тем не менее, нет никаких веских модель грызунов, в котором регенерирующие гепатоциты в основном из БЭК. Хотя несколько моделей грызунов печени токсинов привело к идентификации желчных приводом регенерации печени 2-4, недавние предшественники отслеживания исследования на мышах показывают, минимальный вклад БЭК к регенерации гепатоцитов в этих моделях 9,10. Некоторые из моделей травмы грызунов печени, в том числе частичной гепатэктомии 11-13 и ацетаминофен-индуцированного повреждения печени 14,15, были применены к данио и привело к идентификации новых генов или путей, вовлеченных в регенерации печени. Тем не менее, гепатоцитов приводом, но не БЭК-приводом, регенерация печени происходит в этих рыбок данио модели травмы печени. Таким образом, роман модель травмы печени, в которой БЭК широко способствовать regeneratIng гепатоциты необходим для лучшего понимания БЭК приводом регенерации печени.
Общие цели абляции модели гепатоцитов, описанные здесь, (1), чтобы создать модель травмы печени, в которой БЭК широко способствовать регенерации гепатоцитов, и (2) выяснение молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе БЭК-приводом регенерации печени. Мы предположили, что тяжесть травмы определяет режим регенерации печени; Таким образом, мы прогнозировали, что желчевыводящих приводом регенерации печени будет инициировать на тяжелой травмы гепатоцитов. Чтобы проверить эту гипотезу, мы разработали модель данио печени травмы путем создания трансгенной линии, ТГ (fabp10a: CFP-НТР) s931, что высоко выражает бактериальной нитроредуктазы (NTR), слитый с голубой флуоресцентный белок (CFP) под гепатоцитов конкретных fabp10a промоутер. С НТР преобразует нетоксичные пролекарства, метронидазол (МТЗ), в цитотоксическим препаратом, он ablates только предназначены NTR-экспрессирующих клеток 16-18, в данном случае, гепатоциты. Манипулируя продолжительность лечения МТЗ, степень гепатоцитов абляции может контролироваться. Используя эту модель, мы недавно сообщили, что на тяжелой потерей гепатоцитов, БЭК широко привести к регенерации гепатоцитов 19, которые дополнительно подтверждается двумя другими независимыми исследованиями 20,21. Таким образом, по сравнению с вышеупомянутой грызунов и данио модели повреждения печени, наша гепатоцитов абляции модель является более выгодным для изучения БЭК приводом регенерации печени.
Этот протокол описывает порядок проведения экспериментов регенерации печени с помощью данио модель гепатоцитов абляции. Эта модель будет уместно для определения механизмов, лежащих желчных приводом регенерации печени и химические экраны, чтобы определить небольшие молекулы, которые могут пресечению или усиливают регенерацию печени.
Protocol
Representative Results
Discussion
Тяжелая, но не мягкий, гепатоцитов абляция вызывает желчных приводом регенерации печени. Таким образом, после обработки MTZ и вымывание, важно рассмотреть размер печени в MTZ-обработанной личинок, которые могут быть оценены с помощью собственной флуоресценции CFP от fabp10a: CFP-NTR трансген…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Drs. Hukriede and Tsang for discussions. M.K. was supported by an NIH training grant (T32EB001026). This work was supported in part by grants from the American Liver Foundation, the March of Dimes Foundation (5-FY12-39), and the NIH (DK101426) to D.S.
Materials
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
| goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
| rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
| Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
| confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. | ||
| 10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
| 1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
| PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
| Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |
References
- Riehle, K. J., Dan, Y. Y., Campbell, J. S., Fausto, N. New concepts in liver regeneration. J Gastroen Hepatol. 26, 203-212 (2011).
- Fausto, N., Campbell, J. S. The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation. Mechanisms of Development. 120, 117-130 (2003).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem Cells and Liver Regeneration. Gastroenterology. 137, 466-481 (2009).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration: Alternative epithelial pathways. Int J Biochem Cell B. 43, 173-179 (2011).
- Falkowski, O., et al. Regeneration of hepatocyte ‘buds’ in cirrhosis from intrabiliary stem cells. Journal of hepatology. 39, 357-364 (2003).
- Yoon, S. M., et al. Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) Marks Hepatocytes Newly Derived from Stem/Progenitor Cells in Humans. Hepatology. 53, 964-973 (2011).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213, 286-300 (2007).
- Michalopoulos, G. K. Liver Regeneration after Partial Hepatectomy Critical Analysis of Mechanistic Dilemmas. Am J Pathol. 176, 2-13 (2010).
- Yanger, K., et al. Adult hepatocytes are generated by self-duplication rather than stem cell differentiation. Cell stem cell. 15, 340-349 (2014).
- Schaub, J. R., Malato, Y., Gormond, C., Willenbring, H. Evidence against a Stem Cell Origin of New Hepatocytes in a Common Mouse Model of Chronic Liver Injury. Cell reports. 8, 933-939 (2014).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II alpha is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and cellular biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. 发育生物学. 320, 161-174 (2008).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator, uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Cox, A. G., et al. S-nitrosothiol signaling regulates liver development and improves outcome following toxic liver injury. Cell reports. 6, 56-69 (2014).
- North, T. E., et al. PGE2-regulated wnt signaling and N-acetylcysteine are synergistically hepatoprotective in zebrafish acetaminophen injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17315-17320 (2010).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236, 1025-1035 (2007).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
- Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146, 776-788 (2014).
- Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. , (2014).
- He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146, 789-800 (2014).
- Sakaguchi, T. F., Sadler, K. C., Crosnier, C., Stainier, D. Y. Endothelial signals modulate hepatocyte apicobasal polarization in zebrafish. Curr Biol. 18, 1565-1571 (2008).
- Ninov, N., Borius, M., Stainier, D. Y. R. Different levels of Notch signaling regulate quiescence, renewal and differentiation in pancreatic endocrine progenitors. Development. 139, 1557-1567 (2012).
- Lorent, K., Moore, J. C., Siekmann, A. F., Lawson, N., Pack, M. Reiterative use of the notch signal during zebrafish intrahepatic biliary development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 239, 855-864 (2010).
- Itoh, T., Miyajima, A. Liver Regeneration by Stem/Progenitor Cells. Hepatology. 59, 1617-1626 (2014).
- Mathias, J. R., Zhang, Z., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Enhanced cell-specific ablation in zebrafish using a triple mutant of Escherichia coli nitroreductase. Zebrafish. 11, 85-97 (2014).
- Stueck, A. E., Wanless, I. R. Regression of cirrhosis: The maturation sequence of buds arising from hepatocyte progenitor cells. Hepatology. 58, 235A (2013).
