Colocalizational解析による受容体後の内在トラフィッキングにおける薬物誘発性の変更の追跡
Summary
受容体の輸送は、リガンドへのシグナル伝達と細胞応答を調節し、リガンド誘導シグナル伝達を含む細胞条件に応じて、それ自体です。ここでは、定量的に免疫標識とcolocalizational分析を用いて薬剤誘発性受容体の輸送を評価するための強力で柔軟な技術が記載されています。
Abstract
The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.
Introduction
受容体、特にGタンパク質共役受容体（GPCR）は、日常的に、細胞表面1から、細胞内トラフィッキングされます。これらの複雑に画策し、厳密に制御プロセスは、細胞の利用可能な受容体の相補体を決定し、受容体の時間的活動、脱感作、および再感作2調節– 4。重要なことに、これらの方法は、薬物誘発性受容体活性または非アクティブを含む細胞環境に応答します。つまり、受容体におけるリガンドのアクションは、それによって細胞の応答性を変化させること、これらの受容体の細胞内輸送を変更することができます。このように、外部のリガンドも、古典的なメッセンジャーツーエフェクターカスケード5,6超え、細胞機能にさらにより効果を発揮します。
誘導された受容体の輸送におけるこのような変化を調べることは困難です。すべての利用可能な技術には制限が伴います。ビオチン保護アッセイは、MONIするために使用されていますTOR表面受容体集団。これらの受容体は、ビオチン化され、免疫沈降の時間経過は、時間をかけて、ビオチン化受容体の減少を定量化するために行われます。この技術は、本質的に受容体7の初期、標識された、人口の緩やかな低下を監視し、このプロセスの時間のコースを構築する上で非常に有用です。残念ながら、このアッセイは、内在、リサイクル、または新規の受容体などの受容体のオリジナルプールの劣化以外のプロセスを監視することができません。また、50kDaの範囲の受容体への150kDaの範囲内の抗体の添加は、受容体のトラフィッキング8,9を変更することができ、この技術は、低発現レベルの受容体で使用することは困難です。
他の手順は、細胞内輸送区画（ 例えば、エンドソームなど）を特定し、目的の受容体との共局在を評価するために様々な方法を使用します。これは、私たちを含みます受容体および区画マーカーの蛍光タンパク質タグ付きキメラ構築物（ 例えば、ラブファミリーGTPアーゼ）を発現する異種系の電子。これは、潜在的に固定および透過処理に関連する問題を除去する、生細胞イメージングの使用を可能にします。複数の生理学的に代表的な細胞型と人身売買の動作と互換性がない上のタグおよび発現レベル効果：強力な一方で、このような戦略は、一般的には、異種システムの同じ制限を受けます。もっと一般に、染料が容易に細胞内区画を標識するために使用される（ 例えば、リソソーム、表向きは）10。染料は、しかし、（リソソームのための染料の場合には、すべての酸性オルガネラ）の特異性を欠くことができ、他の区画を通じて人身売買を評価しません。さらに、これらの技術は、システムおよび実験条件にわたってかなりの制御を可能にし、以下、本明細書に提示共局在分析方法から利益を得ることができます。
w法ここで本eは共局在によって受容体輸送の追跡を洗練します。適切なマーカーを標識するために免疫細胞化学（ICC）を使用して、複数の異なる細胞内区画を同定することが可能です。これはまた、異種システムの代わりに、生理的に関連の初代細胞培養物を使用することができます。このICCプロトコルは、標識の前に目的の細胞を固定することを含みます。これは、薬物治療（単数または複数）は、以下の特定の時点での標識を可能にします。これは、その時点でグローバル受容コンパートメントアソシエーションの「スナップショット」を作成します。複数の時点では、トラフィッキングの変化の時間経過をも構成することができます。
簡単に述べると、細胞を、受容体および興味のある細胞内区画のために標識された薬剤処理し、共焦点画像化され、そして顕微鏡写真は、数学的に、受容体コンパートメント11の共局在化を定量するために分析されています。私達の使用では、Raが、受容体の共局在を調べましたB5、Rab11が、リソソーム関連膜タンパク質1（LAMP1）。これらのマーカーは、それぞれ、初期エンドソーム、リサイクルエンドソーム、およびリソソームを識別します。これらの共局在化対策は内在、リサイクル、分解12の包括的なプロセスのためのプロキシとして機能します。
すべての技術と同様に、いくつかの制限が考慮されるべきです。によるすべての個々のニューロンが解析された画像へのニーズに、この技術は、関連する条件および時点の数に応じて、非常に労働集約的になることができます。すべての免疫標識はまた、固定および透過性13によって引き起こされる細胞の超微細構造、タンパク質の局在化、およびエピトープのアクセシビリティへの影響に対応しなければなりません。
もともと一次感覚ニューロンの初代培養物での使用に最適化しますが、この方法は、他の単層メッキ培養モデルと広く互換性があります。
数学的に定量化さmeasurの使用共局在のeは特に、はるかに方法論的に、多くの場合、視覚的に検査し、マルチチャネルのオーバーレイ14のような漠然とした、主観的な措置に依存してきた受容体輸送の変化を評価するために使用される従来の技術よりも厳格です。
この技術は、（前の初代培養の世代に）in vivoでの介入（培養増殖中）、in vitroでの介入との幅広い互換性のために特に有用であり、種々の標識は15を対象としています。このように、多くの異なった研究課題に適合させることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、成人の後根神経節ニューロンの初代培養物（一次感覚ニューロン）の分析のためにこのプロトコルを最適化しました。また、広く、単層メッキ培養細胞について、ほとんど、またはまったく変更することなく、使用することができます。 colocalizational分析しかし、薬物治療、および組織固定/製剤成分は適切ではない、組織切片および他のそのような調製物11も可能です。
<…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はCMCEWOにCIHR（MOP394808）とカナダの研究の椅子からの助成金によってサポートされていましたNSERCから大学院奨学金の受取人でした。
Materials
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps – Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2000 |
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