Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Summary

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Abstract

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) uit volwassen huid fibroblasten en de daaropvolgende differentiatie in somatische cellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties dat histocompatibiliteit barrières te omzeilen. Echter, doorlopen van een pluripotente toestand en daaropvolgende volledige differentiatie in gewenste lineages blijft een wegversperring van de klinische toepassing van iPSC technologie vanwege de geassocieerde neoplastisch potentieel en genomische instabiliteit. Onlangs hebben wij en anderen aangetoond dat somatische cellen niet alleen worden omgezet in iPSCs maar ook in verschillende soorten multipotente somatische stamcellen met gedefinieerde factoren, waardoor progressie omzeilen door de pluripotente toestand. Met name de directe omzetting van humane fibroblasten in veroorzaakte neurale stamcellen (iNPCs) kondigt de mogelijkheid van een nieuw autologe cel bron voor diverse toepassingen zoals mobiele vervanging, ziektemodelen drug discovery. We beschrijven hier de isolatie van volwassen humane primaire fibroblasten uit biopsie huid en het efficiënte directe omzetting in iNPCs door tijdige beperkte expressie van Oct4, Sox2, Klf4, alsmede c-Myc. Sox2-positieve neuro-kolonies verschijnen na 17 dagen van inductie en INPC lijnen efficiënt kunnen worden vastgesteld door monoklonale isolatie en expansie. Nauwkeurige aanpassing van virale multipliciteit van infectie en aanvulling van leukemie remmende factor tijdens de inductiefase vertegenwoordigen kritische factoren conversie rendementen tot 0,2% te bereiken. Tot nu toe kon patiëntspecifieke INPC lijnen te breiden tot meer dan 12 passages en uniform tonen morfologische en moleculaire kenmerken van neurale stam / progenitorcellen, zoals de expressie van Nestin en Sox2. De INPC lijnen kunnen worden gedifferentieerd tot neuronen en astrocyten, zoals beoordeeld door kleuring tegen TUJ1 en GFAP, respectievelijk. Tot slot melden we een robuust protocol voor de afleiding en direct omzetting van de menselijke fibroblasten in stabiel uitbreidbaar neurale stamcellen die een mobiele bron voor biomedische toepassingen zou kunnen bieden zoals autologe neurale cel vervangen en de ziekte modelleren.

Introduction

In 2006 Yamanaka en collega's voor het eerst konden aantonen de mogelijkheid van herprogrammering van somatische cellen in een pluripotente toestand ^1. Deze dedifferentiatie werd bereikt door overexpressie van vier transcriptiefactoren Oct4, Sox2, Klf4, en c-Myc in murine fibroblasten. Het gegenereerde zogenaamde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vertonen functionele equivalentie embryonale stamcellen (SER) en kan dus worden onderscheiden in alle celtypes van het volwassen organisme. Een jaar later herprogrammering iPSCs kan ook worden bereikt voor humane fibroblasten ^2. Experimenten in diermodellen aangetoond dat iPSC-afgeleide cellen kunnen in het algemeen worden gebruikt voor celvervangingstherapie, bijvoorbeeld in Parkinson's Disease (PD) ^3-5. Echter verscheidene beperkingen van het gebruik van iPSCs vormen obstakels voor de volledige hun therapeutisch potentieel. Allereerst herprogrammering van cellen in een pluripotente toestand en daaropvolgendekwaliteitscontrole is over het algemeen een tijdrovend en inefficiënt proces waardoor in uitgebreide en dus dure procedures celcultuur. Ten tweede moeten iPSCs opnieuw worden gedifferentieerd in de gewenste celtype van belang voor biomedische toepassing en de kans op resterende pluripotente cellen in gedifferentieerde latie aanzienlijke tumorigene potentieel en vertoont dus een hoog risico na celtransplantatie ^6. Ten derde, wordt het herprogrammeringsproces gewoonlijk bereikt door het induceren van de herprogrammering factoren door lenti- of retrovirale infectie. De integratie van deze virussen in het gastheergenoom kan leiden tot mutagenese en / of ongecontroleerde heractivering van de transgenen ^7,8. Non-integratieve systemen zijn ontwikkeld om de herprogrammering factoren leveren aan doelcellen, waardoor het risico van insertie mutagenese en transgene reactivering minimaliseren. Voorbeelden van deze transgen vrije benaderingen herprogrammering van cellen met niet-integrerendeAdeno of Sendai virus ^9,10, DNA-gebaseerde vectoren ¹¹ en de toepassing van DNA-vrije werkwijzen zoals transfectie van synthetisch mRNA ¹² of transductie van recombinante eiwitten ^13,14. Een andere veelbelovende methode voor het afleiden van transgene vrije iPSC het gebruik van loxP gemodificeerde lentivirale herprogrammering constructen en daaropvolgende verwijdering van transgenen met het Cre-loxP DNA recombinatiesysteem ^15,16.

Een eenvoudiger benadering van neurale cellen te genereren voor celvervangingstherapie vertegenwoordigt directe omzetting van fibroblasten in post-mitotische neuronen ^17-20. Vierbuchen et al. Gerapporteerd dat de overexpressie van transcriptiefactoren Ascl1, Brn2 en Myt1l resulteert in het genereren van 20% neuronen tegen murine fibroblasten ^17. In 2011 werd aangetoond, dat dezelfde drie transcriptiefactoren in combinatie met overexpressie van NeuroD1 mogelijk transdifferentiatie van humane fibroblasten in neuRons ^19. Human geïnduceerde neuronen kunnen ook worden gegenereerd door overexpressie van Ascl1 en Ngn2 onder dual SMAD- en GSK3β- remming ^20. Met name directe omzetting van fibroblasten in neuronen genereert een non-proliferatie, post-mitotische cel populatie die verdere uitbreiding en biobanking niet toestaat.

Onlangs heeft de directe omzetting van fibroblasten in een prolifererende neurale stamcellen / voorlopercellen cel populatie werd gerapporteerd ^21-26. Duidelijkheidshalve zullen al deze celtypen worden genoemd geïnduceerd neurale stamcellen (iNPCs) in dit rapport. Han et al. Overexpressie Brn4, Sox2, c-Myc en Klf4 iNPCs te genereren. Net als hun tegenhangers neurale stamcellen afgeleid van zowel primaire weefsel of pluripotente cellen deze iNPCs zijn tripotential en kon worden onderscheiden in neuronen, astrocyten en oligodendrocyten ^21. Onze groep rapporteerde een iets andere conversie protocol waarbij overexpressie van Sox2, Klf4En c-Myc en geïnduceerde Oct4 expressie slechts 5 dagen. Met deze aanpak kunnen we stabiel uitdijende iNPCs van muizen embryonale en volwassen fibroblasten dat volledige silencing vertonen van de herprogrammering factoren ²² genereren. In tegenstelling tot iPSCs, hoeft iNPCs geen tumorigeen potentieel vertonen na transplantatie ^27. We gebruikten geconverteerde cellen in een diermodel van demyelinisatie, myeline deficiënte ratten, aangetoond dat iNPCs klinisch bruikbaar ^22. Tot die tijd, kon NPCs alleen worden gegenereerd uit pluripotente stamcellen of primaire zenuwweefsel ^28-32. iNPCs zijn stabiel expandeerbare cellen die kunnen worden gecryoconserveerd en kunnen differentiëren tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Veel inspanningen werden geleverd om de directe omzetting protocol uit muizen passen aan menselijke cellen ^23,26,33,34. In 2012 werd gepubliceerd dat overexpressie van de enkele factor Sox2 in fibroblasten is voldoende om muizen en menselijke iNPCs genereren <sup> 33. De auteurs gemeld generatie van de menselijke iNPCs uit foetaal voorhuid fibroblasten en gekenmerkt hen door kleuring tegen Sox2 en Nestin. De doelwitcellen voor herprogrammering slechts een zeer bepaald celtype die niet met de klinische praktijk en er was geen functionele karakterisatie van omgezet cellen door transplantatie in een diermodel uitgevoerd. Een recente publicatie beschrijft de vorming van neuronale voorlopercellen beperkt uit humane foetale fibroblasten door overexpressie van Sox2, c-Myc en hetzij Brn2 of Brn4 ^34. De gegenereerde cellijnen vertoonden zelfvernieuwingscapaciteit en kunnen worden gedifferentieerd in verschillende soorten terminal neuronen. Echter, het gebruik van foetale fibroblasten ongunstig, omdat deze cellen zijn van heterogene oorsprong naar de aanwezigheid van residuele bijvoorbeeld neurale stamcellen in de preparaten niet uit. In 2014, Zhu et al. Beschreven de directe omzetting van humane volwassen en neonatale fibroblasten in tripotential neurale stamcellen door overexpressie van Sox2 met Oct4 of Oct4 staan ​​toevoeging van kleine moleculen aan het celkweekmedium. Met name op basis van hun studie Sox2 alleen was onvoldoende om rechtstreekse omzetting ²⁶ induceren. Recenter Lu et al. Beschreven dat de overexpressie van het Yamanaka factoren Oct4-, Sox2-, Klf4-, c-Myc van Sendai virus 24 uur en daaropvolgende inactivering van het virus door verhoogde temperatuur resulteert in het genereren van expandeerbare tripotential neurale precursorcellen ^23. Samenvattend, alhoewel de conversie protocollen gepubliceerd menselijke cellen hebben gemeen overexpressie van ten minste één of meer van de Yamanaka factoren vaak tijdig beperkte wijze tot nu toe is er geen duidelijke aanwijzing voor de minimale moleculaire factoren nodig direct besturen omzetting in iNPCs. De tijdige beperkte overexpressie van Oct4 door een genetische middelen transfectie met synthetisch mRNA of cell-permeant eiwit met constitutieve expressie van Sox2, Klf-4, en c-Myc niet resulteren in stabiele humane INPC lijnen nog. Zo is de toepassing van Sendai virus al Yamanaka factoren overexpressie tijdig hun activiteiten beperken door hitte inactivatie van het virus ²³ met geoptimaliseerde neurale media inductieomstandigheden ^22,31 vertegenwoordigt de voorkeursstrategie tot nu toe.

Verschillende studies tonen de mobiele functionaliteit van NSC of hun gedifferentieerde tegenhangers in verschillende dierziekten modellen. Neurale voorlopercellen uit menselijke pluripotente stamcellen werden getransplanteerd in muismodellen van de neuro-inflammatoire aandoening multiple sclerose ^35,36. De toepasselijkheid van hESC-afgeleide neurale stamcellen in EAE (experimentele auto-immune encephalomyelitis) -mice werd voor het eerst getoond in 2008 ^35. Multipotente neurale voorloper cellen werden geïnjecteerd in de ventrikels van de hersenen van muizen, en de transplantatie resultaated in de vermindering van de klinische symptomen van EAE. Kim et al. Gegenereerd oligodendrogliale voorlopers van hESCs en getransplanteerd die intracerebroventriculair in EAE-muizen. Hoewel transplantatie overleefden niet langer dan 10 dagen, muizen vertoonden significante verbetering van neurologische functie en vermindering van proinflammatoire immuuncellen in de witte stof ^36. Stamcel therapie is ook toegepast voor preklinische richten van de ziekte van Parkinson als NPC succes kan worden toegepast bij de respectieve diermodellen. Hiervoor werden progenitorcellen hetzij verkregen uit foetaal hersenweefsel ³⁷ opzichte van pluripotente stamcellen ^38-40 of mesenchymale ⁴¹ stamcellen werden gebruikt. In 2012 toonden we aan dat muis iNPCs kunnen proteolipide eiwit, het belangrijkste myeline eiwitcomponent na transplantatie produceren in de hersenen van myeline-deficiënte (md) ²² ratten. Door dat proof-of-principle experiment de therapeutische applicabilheid van iNPCs werd eerst bewezen en al snel bevestigd door een andere studie ^32. Echter, het volledige potentieel van therapeutische gebruik van menselijke iNPCs moet nog worden onderzocht.

Hier tonen we een robuuste en geïntegreerde werkwijze (i) winning van menselijke primaire cellen uit volwassen patiënten via huidbiopsie, (ii) rechtstreekse omzetting van humane fibroblasten in een neurale staat en (iii) het vermogen van iNPCs worden gedifferentieerd tot neuronale en gliale lijnen. Het gebruik van dit protocol zal helpen bij het versnellen generatie van autologe menselijke cellen voor therapeutische toepassingen.

Protocol

De menselijke fibroblasten die in deze studie werden verkregen uit een huid punch biopsie na het krijgen van informed consent en ethische goedkeuring door de ethische commissie van de Universiteit van Würzburg, Duitsland (ethische verslag nr: 96/11 dd 10.06.2011). 1. Punch biopsie Ontsmet de huid van de patiënt. Verdoven huid waarvan een deel biopsie zal worden genomen van (bij voorkeur een minder zon blootgestelde gebied) met 0,5 tot 1 ml mepivacaine hydrochloride intracutaan e…

Representative Results

Hier presenteren we beschrijving van een geïntegreerd proces genereren van geïnduceerde neurale progenitorcellen (iNPCs) uit humane fibroblasten die zijn verkregen door een punch biopsie van de huid in minder dan 8 weken (figuur 1) mogelijk maakt. Patient-specifeke iNPCs kan verder worden onderscheiden in neuronale en gliacellen geslachten en de haven enorm potentieel voor celvervangingstherapie en de ziekte modelleren. Infectie van de fibroblasten met Oct4-, Klf4-, Sox2- …

Discussion

Hier tonen we de isolatie en rechtstreekse omzetting van humane fibroblasten in expandeerbare-transgen vrije neurale stamcellen en hun gedifferentieerde nakomelingen als mogelijke basis voor cell-vervangingstherapie of toepassing in geneesmiddelscreening analyses. Direct lineage omzetting van somatische cellen in NPC is bereikt door geforceerde expressie van afstammings-specifieke transcriptiefactoren ^26,33,34. Niettemin vaak foetale fibroblasten werden voor transdifferentiatie experimenten ^33,34. …

Materials

Astrocyte media	ScienCell	1801
B27	LifeTechnologies	17504-044
BDNF	Peprotech	450-02
Biopsy Punch	pfm medical	48301
cAMP	Sigma	A6885
CHIR99021	Axon medchem	1386
Collagenase Type2	Worthington Biochemical	LS004177
Dispase	PAN	P10-032100
DMEM	LifeTechnologies	41966-029
DMEM F12	LifeTechnologies	11320-033
DMSO	Roth	4720
DPBS	LifeTechnologies	14190-094
EGF	Life Technologies	PHG0313
FCS	Biochrom AG	50115
GDNF	Peprotech	450-10
Gentamicin	Sigma	G1397
GFAP-antibody	Dako	Z0334
GlutaMAX	LifeTechnologies	35050-038
hLIF	Peprotech	300-05
Insulin	Seralab	GEM-700-112-P
Ki67-antibody	NeoMarkers	RM-9106-S
L-Glutamine	LifeTechnologies	25030-024
Laminin	Sigma	L2020
N2	LifeTechnologies	17502-048
Nestin-antibody	R&D Systems	MAB1259
Neurobasal	LifeTechnologies	21103-049
Non-essential amino acids	LifeTechnologies	11140-050
NSC freezing media	Sigma	C6295
Oct4-antibody	Santa Cruz	sc9081
Pax6-antibody	Covance	PRB-278P
SB431542	Invivogen	inh-sb43
Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit	LifeTechnologies	A1378001
Sodiumpyruvate	Life Technologies	11360-039
Sox1-antibody	R&D Systems	AF3369
Sox2-antibody	R&D Systems	MAB2018
T3	Santa Cruz	sc-205725
Trypsin/EDTA	Life Technologies	15400-054
TUJ1-antibody	Covance	MMS-435P-250
Vitamin C	Sigma	A4544
Y27632	Calbiochem	CAS 146986-50-7
β-Mercaptoethanol	LifeTechnologies	21985023