원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학
Summary
We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.
Abstract
Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.
Introduction
원자 힘 현미경 (AFM)은 매우 날카로운 팁 (1)과 캔틸레버를 사용하여 샘플의 영역에 걸쳐 주사함으로써 표면의 화상을 생성한다. 캔틸레버의 이동은 시료의 표면 토폴로지를 프로빙. 액체 2-5에 공기 또는 거의 원시 상태에서 고정 된 샘플을 분석하는 그 다양성 때문에, 단백질, DNA와 세포막을 포함하여 – AFM 널리 생체 분자에 적용되었습니다.
외에 나노 미터 범위에서의 고해상도 영상화 능력에서, AFM 캔틸레버는 작용 힘 (부착 및 반발력) 및 샘플 5,6의 기계적 특성을 조사하기 위해 스프링 역할을한다. 이것은 힘 분광법으로 알려져있다. 이 모드에서, 프로브는 먼저 샘플 (도 1a)과 접촉을 상실 할 때까지 후퇴되고, 시료에 접근하고 그것에 힘을 발휘한다. 생성 된 곡선은 앱 모두 캔틸레버의 거리의 함수로서 힘을 보여바퀴벌레과 후퇴. 탄성률 등 여러 가지 특성은 재료의 강성을 측정하고, 접착력이 유도 될 수있다.
지원 지질 이중층은 고체 지지체 위에 누워 생물학적 모델 막이다 – 보통 운모, 붕 규산염 유리, 용융 실리카, 또는 실리콘 산화 7. 이들은 소포 증착과 같은 다양한 기술을 사용하여 제조되며, 랭 뮤어 – 블로 젯 방법 및 8,9 스핀 코팅. AFM 영상이 지원 이중층 (10)의 형성을 수행하고, 상이한 조성 11-15의 멤브레인에 의해 형성된 상이한 구조를 조사하기 위해 사용되었다.
접근 곡선의 피크에서 지원 이중층 결과에 힘 분광법을 수행. 이 피크는 이중층을 관통하기 위해 필요한 힘을 나타내고, 획기적인 힘이라고 부른다. 이중층의 두께는도 6 힘 곡선을 사용하여 측정 될 수있다. 이중층의 전형적인 획기적인 힘1-50 사이의 범위 윈 6. 이러한 특성은 지질 포장 (액체 또는 젤 상)과 구조 (아실 체인 길이와 불포화도)과 막 활성제 (16)에 의해 변경에 따라 달라집니다. 파열 배후 이론은 17을 설명했지만 이러한 캔틸레버 부드러움, 팁 반경 및 접근 속도와 같은 다른 변수는 실험 15, 16, 18 획기적인 힘에 영향을 미친다. 포스 분광법은 막 (21)의 안정성, 다른 지질 상 11,19, 펩티드 등 조성 의존성 12,20 변화뿐만 아니라, 다른 생 분자의 효과의 특성을 분석하기 위해 사용되어왔다.
지원 이중층의 평면 방향은보다 구조 및 막의 성질을 특성화하기 위해 이러한 표면 플라즈몬 공명 (22) 및 형광 현미경 11,19 같은 다른 방법으로 결합 AFM 유리하다.
이 자세한 영상 프로토COL은 소포 증착을 사용하여 지원 된 지질 이중층을 준비하고 AFM 힘 분광기로 분석하도록 구성된다. 다양한 크기의 소포는 이중층을 제조하는데 사용될 수 있지만,이 프로토콜은 소형 및 대형 단층 라멜라 소포에 초점을 맞춘다. 상 액체 주문 (패 O) 및 액체 무질서 (패 D) 단계로 분리 지원 이중층은 11, 15을 특징으로했다. 2 : 1의 비율로 막 2에 디 – 올레 일 포스파티딜콜린 (DOPC), 스 핑고 미엘린 (SM), 및 콜레스테롤 (Chol을)로 구성된다. 이 구성 모델 단백질 인신 매매 및 정렬, 세포 신호 및 다른 세포 과정 (23, 24)에 대한 중요한 플랫폼으로 작동하도록 제안 지질 뗏목,.
Protocol
Representative Results
Discussion
DOPC 이루어지는 SLB 수 : SM : Chol을 (2 : 2 : 1) 염화 칼슘에 의한 소포 흡착 및 파열 후에 운모 상에 형성 하였다. 이 지질 조성물 L D와 L 오 상으로 분리 하였다. L 오 단계는 스 핑고 마이 엘린과 콜레스테롤이 풍부한과 L의 D 단계 (11)보다 적은 유체 / 점성 (그림 1A)이다. L의 D 단계에서 L 오의 분리 주변 (그림 1B, C) ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 (NO. 0,312,040 부여) 막스 플랑크 협회, 독일 암 연구 센터, 튀빙겐 대학과 Bundesministerium 대 Bildung 놀이 Forschung에 의해 지원되었다.
우리는 우리가이 원고의주의 독서의 힘 곡선 데이터와 박사 야콥 Suckale의 분석을 자동화 도와 에드워드 헤르만 감사합니다.
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850375P | Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sphingomyelin (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 860062P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sodium chloride (NaCl), 99.8% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 9265.1 | |
| Potassium chloride (KCl), 88% | Sigma | P9541 | |
| Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% | AppliChem GmbH | A1046 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904.1 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade | AppliChem GmbH | A4689 | |
| HEPES, molecular biology grade | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Glass coverslip, 24×60 mm, 1mm thickness | Duran Group | 2355036 | |
| Mica blocks | NSC Mica Exports Ltd. | These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set. Always handle mica with gloves or tweezers. | |
| Punch and Die Set | Precision Brand Products, Inc | 40105 | |
| Optical Adhesive | Norland Products, Inc. | NOA 88 | Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. |
| Laboratory Equipment Grease | Borer Chemie AG | Glisseal N | |
| Liposome Extruder | Avestin | LiposoFast-Basic | As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc. |
| Adhesive Tape | 3M | Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch) | |
| Bath Sonicator | Bandelin Sonorex Digitec | DT-31 | No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf |
| Silicon Nitride AFM Cantilever | Bruker AFM Probes | DNP-10 | Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m. |
| AFM | JPK | JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200 |
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