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免疫与感染

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

Published: June 25, 2015
doi:
10.3791/52903
, , ,
1Department Biologie,Friedrich-Alexander-Universität, 2Institut für Molekulare Pathogenese,Friedrich-Loeffler-Institut, 3Mikrobiologisches Institut – Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene,Universitätsklinikum Erlangen

Summary

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Abstract

여기에 제시된 기술은 신호 전달 경로의 구성 요소와 상호 작용하는 하나의 표적 단백질, 또는 대안 적 소분자 단계를 분석 할 수있다. 방법을 기반으로 한 손으로, 특정 단백질의 발현 유도에 선택된 시그널링 캐스케이드에서 정의 된 소정의 단계에서의 시그널링 이벤트를 개시한다. 발현 된 목적 단백질의 활성이 얻어지는 신호 전달 경로의 판독에 따라, 상류 측에 위치 또는 개시 시그널링 이벤트의 하류 경우 병용 식 반면에, 관심의 유전자의 후 조사자 평가할 수있다. 여기, 세포 사멸 폭포는 프로토콜의 기능을 보여주기 위해 정의 된 신호 전달 경로로 선정되었다. 이러한 Coxiella burnetii 등의 병원균, 박테리아 세포에서의 생존을 보장하기 위해 숙주 세포에서 숙주 세포 사멸 유도 방해 효과기 단백질을 이동시키다 촉진 그들의유기체의 보급. C. burnetii 효과기 단백질 CaeB 효과적으로 UV 광 또는 스타 우로 스포린과 함께 아폽토시스의 유도 후 숙주 세포 사멸을 억제한다. 단계 CaeB는 세포 사멸 신호의 전파를 방해하는 좁히려, 잘 특성화 프로 – 세포 사멸 활성을 선택 단백질은 독시사이클린 유도 방식으로 일시적으로 발현되었다. CaeB이 단백질의 상류 역할을하는 경우, 세포 사멸은 방해받지 않고 진행됩니다. CaeB 하류 작용하면, 세포 사멸을 억제한다. 선택된 테스트 단백질 주요 집행자 프로테아제 인 미토콘드리아의 레벨, 및 카스파 제 3, Bax의 작용에이었다. CaeB는 Bax의 발현에 의해 유도되는 세포 사멸을 방해,하지만 카스파 제 3 식으로. CaeB, 따라서,이 두 단백질 사이의 사멸 캐스케이드와 상호 작용한다.

Introduction

많은 그람 음성 박테리아 병원균의 독성은 진핵 숙주 세포를 납치 전문 분비 시스템에 따라 달라집니다. 박테리아 세포 생화학 다양한 활동을 조절하는 숙주 세포에 박테리아 병원성 단백질 (이펙터) 주입이 분비 시스템을 사용한다. 효과기 단백질의 연구는 호스트 / 병원균 상호 작용의 기본적인 양상에 또한 진핵 세포 (1)의 기초 생물학에 현저한 통찰력을 제공하고뿐만 아니라. 숙주 세포 사멸의 조절은 많은 세포 내 병원체에 대한 중요한 독성기구 것으로 도시되었으며, 세포 사멸을 조절 효과기 단백질의 수는 2-9 확인되었다. 그러나, 이들 활동의 정확한 분자 메커니즘은 많은 경우에 남아 도비.

아폽토시스 프로그램 된 세포 사멸의 형태는 감염 10의 면역 반응에서 중요한 역할을한다. 세포 사멸에 이르는 두 가지 주요 경로는이확인되었다 : 원형질막 (외인성 사멸)에서 세포 사멸 수용체를 통하여 미토콘드리아 (극한 아폽토시스) 또는 신호 전달의 직접적인 타겟팅. 고유 또는 미토콘드리아 매개 세포 사멸 경로는 세포 내 신호에 의해 트리거 백스와 박,하는 Bcl-2 가족의 두 프로 – 세포 사멸 회원의 활성화를 포함한다. 이 패밀리는 세포 사멸을 조절 11-14 프로 및 안티 사멸 조절 단백질로 구성된다. 백스와 박가 세포질에 시토크롬 C 릴리스의 결과로, 미토콘드리아 외막의 후속 투과성으로 다음의 세포 사멸의 활성화는 올리고머로 연결됩니다. 시토크롬 C의 릴리스는 apoptosome을 15 카스파 제 9의 활성화를 통해 이펙터 카스파 3과 7의 활성화를 시작합니다. 이것은 다른 사람의 사이에서, 세포 표면 (16)에 포스파티딜 세린의 노출 결과, 선택된 기판의 단백질 분해로 연결하고 채널을 프래그먼트 전용 DNase의를 해제romatin (17, 18).

개별 이펙터 단백질 방해 사멸 캐스케이드 내에 유도 발현 시스템 (19)을 사용 위치를 판별하기 위해. 유전자의 조건식을위한 규제 시스템은 세포 내에서 단백질의 기능이나 조직, 기관 및 유기체 개발의 중요성뿐만 아니라, 개시, 진행 및 질병 20-23의 유지 보수시를 분석에 매우 중요한 도구왔다. 전형적으로, 이러한 시스템 테트 금회 24 유도 성 제어 시스템은 인공 전사 부 (도 1 참조)를 형성한다. 하나의 컴포넌트는 전사 활성화 또는 24, 26 사일런을 매개 포유류 단백질 도메인 박테리아 전사 리프레 TetR 25의 융합에 의해 형성 TTA (테트라 사이클린 – 의존성 전사 활성제)라고 인위적 조작 된 전사 인자이다. 2 성분은 하이브리드프로모터, 적어도 TATA 박스 및 전사 개시 부위를 포함하는, 진핵 최소 프로모터로 이루어진, TRE (테트라 사이클린 – 반응 요소)라고 TetR, TETO 24,25 대한 동족 DNA 결합 부위의 다중 반복에 접합. 제 3 성분은 TetR, 테트라 사이클린 또는 독시사이클린 또는 anhydrotetracycline 25 그의 유도체, 하나의 천연 리간드이다. 문화 매체에 리간드 또한시, TetR는 TETO에 대한 친 화성을 ​​잃고 트레에서 해리. 결과적으로, 표적 유전자의 전사가 폐지된다. 형질 전환 유전자 발현, 즉, 단단히 모두 세포 배양 시간 및 용량 – 의존적으로 동물 20,23,24 제어 될 수있다. TTA으로, 도입 유전자의 발현은 항생 물질의 존재를 제외하고는 구조적으로 발생한다. 테트라 사이클린 제 트랜스 expressio 전에, 시스템으로부터 제거되어야하기 때문에 이는 세포 독성 또는 발암 단백질의 연구에서 불리 할 수​​있다N이 발생하고 세포에 표적 단백질의 효과를 모니터링 할 수있다. 이것은 많은 시간이 소요될 수 특히 형질 전환 동물 (27)에, 항상 완전하지 않습니다 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 독시사이클린의 존재에 응답하여 역으로 TetR 변이주 새로운 전사 인자를 생성하는 데 사용 된, rtTA 28 (TTA 역방향). 그것은 단지 TRE에 결합하고, 부수적으로, 독시사이클린의 존재 하에서 전사를 활성화시킨다. 시스템, 즉 잔류 leakiness., TRE – 결합 전사 인자의 부재하에 트랜스 유전자 발현, 게놈 통합 사이트 위치 효과로부터의 (ⅰ)을 발생, (ⅱ) TRE 자체 (29), 또는 (ⅲ) 비부터 특이 TTA / rtTA 28의 결합, 추가 전사 사일런서를 도입하여 해결하고, 시스템 (테트라 사이클린 – 의존성 전사 소음기) (30)를 TTS 불린다. 그것은 rtTA (도 1 참조)과 함께 이중 조절기 네트워크를 형성한다.독시 싸이클린이없는 경우, TTS는 트레에 결합 적극적으로 남아있는 전사를 종료합니다. 독시사이클린의 존재 하에서 TTS는 TRE로부터 해리 rtTA 동시에 표적 유전자의 발현을 유도 결합한다. 엄격이 추가 레이어는 활성이 높은 세포 독성 단백질 31-34을 표현하는 것이 필요하다.

이 엄격하게 제어 듀얼 레귤레이터 시스템을 사용하여 세포 사멸 캐스케이드 주어진 이펙터 단백질이 아폽토시스 유도를 방해 할 수 있는지 여부를 분석 할 수 있도록 정의 단계에서 시작될 수있다. 이 방법은 세균 효과기 단백질의 세포 자멸 억제 활성을 연구하기 위해 사용될뿐만 아니라, 프로 – 세포 사멸 또는 독성 단백질의 발현을위한 유도 성 또는 다른 신호 전달 경로와 간섭을 해부 용 수 없다.

Protocol

관심의 단백질을 발현 안정적인 세포주 1 세대 열 – 불 활성화 FCS 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 첨가하여 용지를 준비 시판 Dulbecco's은 루타-I, 피루브산 4.5 g / L D- 글루코스로 보충 된 이글 중간 (DMEM)를 수정한다. 5 % CO 2에서 37 ° C에서 미디어 HEK293 세포를 배양. 모든 사흘 세포를 하위 육성. 용지를 제거하고 15 ml의 신선한 매체 세포를 재현 탁. 새로운 75cm 2 …

Representative Results

먼저, GFP 융합 단백질로서 안정적으로 관심 (CaeB)의 단백질을 발현하는 HEK293 세포주를 확립 하였다. 대조군으로서, 안정적 GFP를 발현 HEK293 세포주는 또한 생성 하였다. 및 GFP-CaeB GFP의 발현은 면역 블롯 분석에 의해 확인되었다. 대표적인 면역 (그림 4A)는 GFP와 GFP – CaeB의 안정적이고 명확하게 검출 식을 보여줍니다. 모든 세포가 GFP 또는 GFP – CaeB을 표현 여부 그러나이 분석은 확인할 수 …

Discussion

많은 병원성 박테리아는 분비 또는 숙주 세포에 박테리아 효과기 단백질을 분비하기 위해 이동시키다 시스템 항구. 이러한 이펙터 단백질은 박테리아가 생존하고 각 세포의 틈새 내에 복제 할 수 있도록 숙주 세포에서 처리하고 경로를 조절하는 능력을 갖는다. 생화학 활동 및 효과기 단백질의 분자 메커니즘을 이해하면 병원성의 더 나은 이해를 향해 도움 질병을 퇴치하기위한 새로운 치료 도?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.

Materials

DMEM life technologies 31966-021
FCS Biochrom S0115
Pen/Strep life technologies 15140-122
OptiMEM life technologies 51985
X-tremeGENE 9 Roche 6365752001
Geneticin Roth CP11.3
Polyethylenimine Polyscienes 23966
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 170-3940
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Scientific 26616
PVDF membrane Millipore IPVH00010
anti-GFP  life technologies A6455
anti-cleaved PARP BD Bioscience 611038
anti-actin Sigma Aldrich A2066
Mouse IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-045
ECL Western Blotting Substrate Thermo Scientific 32106
Restore Plus Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 46428
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References

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Berens, C., Bisle, S., Klingenbeck, L., Lührmann, A. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (100), e52903, doi:10.3791/52903 (2015).
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