We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.
Einen der wesentlichen Prozesse der Entzündung ist die Infiltration von Immunzellen aus dem Lumen des Blutgefäßes zu dem umgebenden Gewebe. Dies geschieht, wenn Endothelzellen, die die Blutgefäße auskleiden, werden Klebstoff auf zirkulierenden Immunzellen, wie Monozyten. In vitro-Messung der Haftfestigkeit wurde bis jetzt durch die Quantifizierung der Zahl der Monozyten, die einer Endothelschicht haften entweder als direkte Zählung geschehen oder durch indirekte Messung der Fluoreszenz der anhaftenden Monozyten. Während solche Maße tun gibt die durchschnittliche Haftfestigkeit der endothelialen Zellpopulation, werden sie von einer Reihe von Faktoren, wie beispielsweise Zellzahl verwechselt werden, und der Anteil der Endothelzellen, die tatsächlich Klebstoff nicht verraten. Hier beschreiben wir und zeigen ein Verfahren, das die Zählung von Haftzellen innerhalb eines Versuchspopulation der endothelialen Monoschicht ermöglicht. Endothelzellen werden auf Deckgläsern gezüchtet und nach WunschBehandlung mit Monozyten in Frage gestellt (das fluoreszenzmarkierte werden kann). Nach der Inkubation einer Spülprozedur, die mehrere Runden des Eintauchens und Entleeren werden die Zellen fixiert. Klebstoff Endothelzellen, die durch Monozyten, umgeben sind, leicht identifiziert und aufgezählt, so dass eine Haftindex, den tatsächlichen Anteil der Endothelzellen in der Population, die Klebe, offenbart.
Infiltration von Immunzellen, wie Monozyten durch die endotheliale Zellschicht, die Blutgefäße auskleiden, ist ein wichtiger Schritt im Entzündungsprozess 1. Dies ermöglicht die Referenzierung von Immunzellen (Immunzellen) zu einem Ort der Verletzung. In anderen Fällen und Orten wie der koronaren Arterie und Carotis Arterie kann die Infiltration von Monozyten durch Endothel um das unerwünschte langfristiger Aufenthalt dieser Zellen in die Wand der Arterie führen, was möglicherweise zur Bildung von Plaques 2 führt. In allen Fällen der Immunozyt Infiltration, beinhaltet der erste Schritt der Aktivierung der Endothelzellen in einem lokalisierten Bereich des Blutgefäßes. Endothelzellen werden durch proinflammatorische Zytokine wie TNF-α und IL-6, um die Expression von Zelloberflächenproteinen, wie VCAM, ICAM und E-Selectin, welche die Einstellung und Befestigung des Immunozyten auf die Endothelzelloberfläche 3- erleichtern erhöhen aktivierten 6.
<p class = "jove_content"> Zunächst Messung Endothelzelladhäsion wurde durch Zählen Monozyten, die Monoschicht 7 endotheliale halten durchgeführt. Die Grenzen dieses Verfahrens in Bezug auf Genauigkeit führte zur Verwendung von radioaktiv markierten Lymphozyten oder Monozyten, gefolgt von Quantifizierung der radioaktiven Materials, das Lymphozyten oder Monozyten Adhäsion 4 entspricht. Dieses Verfahren wurde schließlich durch eine auf Fluoreszenz basierende Methode, wobei die Immunozyten von Interesse wurden mit Fluoreszenzfarbstoff, wie oben mit dem Unterschied, dass die Fluoreszenz anstelle von Radioaktivität markiert und mit demselben Verfahren gemessen, 8 ersetzt. Derzeit ist diese Methode als die bequemste entstanden und wird als Bausatz von mehreren kommerziellen Anbietern vertrieben. Während dieser Assay relativen Grade der Haft zwischen Kontrollen und Versuchsproben zu messen, ist es nicht erkennen, ob eine Veränderung der Fluoreszenz ist auf eine gleichmäßige Veränderung der Haftfähigkeit über die gesamte Endothelial Zellpopulation oder wenn die Änderung auf Grund einer Differenz des Haftvermögens innerhalb einer Subpopulation von Zellen. Es ist auch offensichtlich, dass die Stringenz der Wasch übt einen großen Einfluss auf das Ergebnis, und was noch wichtiger ist, wird die Gleichförmigkeit der Abspülen ungebundenen Monozyten zwischen verschiedenen Endothelzell-Monoschichten stark vom Grad der Übereinstimmung der Ergebnisse von Wiederholungsversuchen und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zwischen den Proben auswirken . In jüngerer Zeit mehrere Systeme, die Monozyten auf eine endotheliale Zellschicht Pumpe in Medien wurden verwendet, um dieses Problem anzugehen 9. Darüber hinaus sind diese Flusssysteme die Wirkung der Scherkraft auf den Endothelzellen rekapitulieren auch. Während die Vorteile dieser Systeme sind klar und sehr attraktiv ist, ist es auch wichtig zu erkennen, dass, während endothelialen Zellhaftfähigkeit kann stark erhöht werden, wie es bei akuten Entzündungen der Fall ist, die durch Faktoren wie TNF & einigen anderen Aktivatoren, wie ionisierende Strahlung 10 entlocken ändert that nicht ohne weiteres in in vitro Versuchszeitrahmen von diesen sehr strengen Systemen erkannt. Während solche kurzfristigen Änderungen der endothelialen Zellhaftfähigkeit nicht leicht zu entdecken oder in vitro entlassen, ist es nicht in vivo, wenn diese kleinen Änderungen innerhalb eines Lebenszeit, die charakteristisch für die chronische Entzündung ist, kann auch Resultate ausüben notwendigerweise gutartig. Daher ist eine robuste und zugleich empfindliche und spezifische Verfahren zum Nachweis und zur Messung von Endothelzellen Klebrigkeit erforderlich ist.Hier berichten wir ein Verfahren zur Haftfähigkeit der Endothelzellen direkt zu messen. Dieses Verfahren hängt nicht von der Fluoreszenzmessung angewiesen als indirekter Indikator Surrogat endothelialer Zellhaftfähigkeit. Es offenbart, ob Änderungen in Haftfähigkeit durch einheitliche Änderung in allen Zellen oder zu einer Teilpopulation beschränkt sind. Ferner ermöglicht es co-Färbung von Endothelzellen mit Markern wie Seneszenz-assoziierte & beta; -Galactosidase, die Lebensfähigkeit der Zellen marker, Calcien AM und Antikörper gegen Zelloberfläche und intrazellulären Proteinen, so dass die Zuordnung der einzelnen Klebstoff Endothelzellen an bestimmte Zellzustände oder Expression spezifischer Proteine.
Die oben beschriebene Monozytenadhäsion Assay wurde erfolgreich in Experimenten entwickelt, um die biologischen Wirkungen von ionisierender Strahlung auf endothelialen Monoschichten 10 Studie verwendet. Obwohl dies nicht die einzige Methode zur Verfügung, um die Haftfähigkeit einer endothelialen Monoschicht zu bewerten, ist es das einzige Verfahren, das die Quantifizierung der Anteil oder Prozentsatz der Endothelzellen in einer Monoschicht, die Klebemittel ermöglicht. Dies ist ein wichtiger Unterschied, als globale quantitative Änderung der Haftung der Monozyten kann durch andere Methoden gemessen, entweder auf eine allgemeine Erhöhung der Haftfähigkeit aller Zellen der endothelialen Monoschicht oder auf die Erhöhung Haftfähigkeit einer Teilpopulation von Endothelzellen zurückzuführen in der Monoschicht, wie im obigen Beispiel gezeigt. Der Wert der mit diesen Daten wird durch die Tatsache veranschaulicht, dass die Fähigkeit der Anteil der Endothelzellen, die eine verbesserte Haftfähigkeit zeigte quantifizieren nach Bestrahlung führte zu den inesfähig Schlussfolgerung, dass dieser Effekt nicht auf genetische Mutation eines bestimmten Gens als der Prozentsatz von Zellen, die Klebstoff waren, waren wesentlich höher (mehr als 1000-mal mehr), was aus zufälligen Mutation eines Gens durch Röntgenstrahlung bei dieser Dosis zu erwarten wäre, .
Der Faktor, der eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ermöglicht, ist die Waschregime. Als Waschverfahren beinhaltet das Eintauchen des Glasdeckglases in Waschpuffer, gefolgt von Abtupfen auf einem Gewebe, wird die Variabilität in der Puffer Turbulenz, die zwangsläufig entsteht aus der alten Methode der Zugabe der Waschpuffer in ein Bohrloch vermieden. Tatsächlich war es die Beobachtung der übermäßigen Variabilität zwischen Wiederholungen mit der Pipettierverfahren die uns gezwungen, einen Waschvorgang, der die Variabilität Element aus dem Waschschritt entfernt ersinnen erhalten.
Zugegeben, die Grenzen dieses Tests liegen in der Notwendigkeit zur Durchführung von manuellen Zählung der Monozyten-Cluster, die n tunot damit sie angepasst werden für die Hochdurchsatzanalysen. Zweitens hat die Entscheidung darüber, wie viele Monozyten bilden ein Cluster bis halb willkürlich festgelegt werden und der Pegel zu hoch eingestellt und führen zum Ausschluss von einigen echten Cluster werden. Der Mangel an Schubkraft in diesem Verfahren kann auch als eine Beschränkung in Experimenten, in denen grob verbesserte Haftfähigkeit von Endothelzellen induziert (zB + TNFa) betrachtet werden. In anderen Situationen ist jedoch die mangelnde Scherkraft ein Vorteil, da es den Nachweis von weniger triebene Steigerung des Haftvermögens ermöglicht. Moderaten Anstieg der Monozyten Haftfähigkeit besonders wichtig und relevant sein. In vivo würde Monozyten nicht (in einer typischen Versuchszeit) erwartet, in großer Zahl anzubringen, um Zellen mit moderaten Anstieg der Haftfähigkeit, vor allem aufgrund einer Scherkraft endotheliale werden. In der Zeit jedoch würden wahrscheinlich einen Monozyten, und dies ist eher die Umgebung der chronischen Entzündung dar. Als solche,die Abwesenheit von Scherkraft kann ein Vorteil sein, da es die Möglichkeit bietet geringen Anstieg des endothelialen Zellhaftfähigkeit in Versuchszeitrahmen, die typischerweise kurz und möglicherweise zu flüchtig, um zu ermöglichen bescheidene Erhöhung der Haftfähigkeit unter Scherbeanspruchung beobachtet werden offenbart werden.
Die Fähigkeit, die Zellen nach diesem Test zu anderen Analysen wie Seneszenz Assays und Immunfluoreszenz-Färbung unterwerfen erhöht die Nützlichkeit dieses Verfahrens, wie es erlaubt die Assoziation von Haft spezifischer Endothelzellen an bestimmten zellulären Proteinen oder Zellzuständen, wie oben gezeigt, eine Funktion, die ist nicht verfügbar, mit den älteren Adhäsionsassays.
Dieses Verfahren wurde mit est2 immortalisierte menschliche koronare Endothelzellen und ähnlichen Ergebnissen verwendet wurden auch mit primären menschlichen Koronar-Endothelzellen 10 erhalten, was zeigt, dass es nicht spezifisch für nur eine bestimmte Zelllinie. Auch die adoption dieses Verfahren zum Testen der Haftfähigkeit Endothelzellen nicht entgegenWerfen der gleichen Zellen auf die Standard Adhäsionsassay die Fluoreszenz von markiertem Immunzellen mißt. Gemeinsam dieser Bericht zeigt, dass diese Methode ist vielseitig, inclusive und bietet viel mehr Informationen als die Standard Adhäsionsassay.
The authors have nothing to disclose.
We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Hepes Buffered Saline Solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
Glass coverslips Round 12mm Diameter | Menzel-Glaser | CB00120RA1 | |
24-well cluster plate | Costar | 3526 | |
Meso-Endo Cell media | Cell Applications | 212-500 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
Soybean trypsin inhibitor | Life Technologies | 17075-029 | |
Cell Tracker Green | Life Technologies | C7025 | |
RPMI | Sigma | R8758 | |
Foetal Calf Serum | Life Technologies | 10500064 | |
Beta glasctosidase Assay kit | CellSignaling | 9860 | |
Fibronectin | Sigma | F0895 |