Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

Summary

O protocolo de imunofluorescência indirecta descrito neste artigo permite a detecção e a localização de proteínas na glândula mamaria do rato. Um método completo é dada para preparar amostras da glândula mamaria, a efectuar imuno-histoquímica, para as secções de tecido imagem por microscopia de fluorescência, e para reconstruir imagens.

Abstract

A imunofluorescência indirecta é utilizado para detectar e localizar as proteínas de interesse num tecido. O protocolo aqui apresentado descreve um método completo e simples para a detecção imunológica de proteínas, o rato lactantes glândula mamária ser tomado como um exemplo. Um protocolo para a preparação das amostras de tecidos, especialmente em relação a dissecção da glândula mamária do mouse, fixação do tecido e corte de tecido congelado, são detalhados. Um protocolo padrão para executar imunofluorescência indireta, incluindo uma etapa de recuperação antigênica opcional, também é apresentada. A observação de as secções de tecido etiquetados, bem como a aquisição de imagem e os pós-tratamentos também são apresentados. Este procedimento dá uma visão geral completa, desde a coleta de tecido animal para a localização celular de uma proteína. Embora este método geral pode ser aplicada a outras amostras de tecido, deve ser adaptada a cada tecido / anticorpo primário par estudado.

Introduction

A glândula mamária é um órgão de mamíferos exócrina atípica cuja principal função é produzir leite para alimentar recém-nascidos. O desenvolvimento do tecido mamário ocorre principalmente após o nascimento e é caracterizada por um processo único, em que o epitélio invade o estroma circundante. Este tecido sofre muitas mudanças (crescimento, diferenciação e regressão), especialmente durante a vida adulta, concomitantemente com variações no estado reprodutivo (Figura 1). Além da morfologia geral do tecido, as proporções de tipos de células diferentes, bem como a sua disposição no interior da glândula mamaria mudar dramaticamente durante o desenvolvimento ^1-5.

Durante a vida embrionária, o epitélio mamário deriva de linhas de leite mamarias, que é definido por um ligeiro espessamento e estratificação da ectoderme, entre as partes dianteiras e traseiras dos membros de cada lado da linha média por volta do dia embrionário 10,5 (E10.5) (Figura 1A ).Em E11.5, a linha do leite se divide em placodes individuais, que são posicionados simetricamente ao longo da linha de leite mamário em locais reprodutíveis, eo mesênquima circundante começa a condensar. Os placodes começar a afundar-se mais profundamente na derme e no mesênquima mamária organiza em camadas concêntricas ao redor do broto mamário (E12.5-E14.5). Em E15.5, o epitélio mamário, começa a proliferar e alongada para formar o rebento principal que empurra através do mesênquima mamária para a almofada de gordura. O rebento principal desenvolve um lúmen oco com uma abertura para a pele, caracterizado por a formação da bainha de mamilo. Em E18.5, o ducto alongando tem crescido na almofada de gordura e tem ramificações em um pequeno sistema ductal arborized englobadas na almofada de gordura. O desenvolvimento é essencialmente preso e da glândula mamária rudimentar permanece morphogenetically de repouso até a puberdade. No embrião do sexo masculino, a activação de receptores de androgénio conduz à degeneração dos gomos, que desaparecempor E15.5. Em E18, desenvolvimento mamário cessa puberdade até ^6-9.

Ao nascer, a glândula mamária abriga um sistema ductal rudimentar que alonga e ramos lentamente (crescimento isométrico). No início da puberdade, as estruturas esféricas localizadas nas pontas dos ductos chamado as papilas extremidade terminal (TEBS), são formadas por uma camada externa de células do tampão e um núcleo interior de várias camadas de células (células do corpo). Estas estruturas são altamente proliferativo e infiltrar o tecido do estroma circundante, em resposta a estímulos hormonais. Proliferação dentro dos resultados TEBS em alongamento ductal, juntamente com ramificação morfogênese. Este processo leva ao estabelecimento de uma rede de base epitelial arborized que emana do bocal (Figura 1B, a puberdade). A ~ 10-12 semanas após o nascimento, quando o epitélio invadiu toda a almofada de gordura, a sua expansão pára e a TEBS desaparecer. Desenvolvimento ductal, em seguida, passa por mudanças dinâmicas, ou seja, successive proliferação e regressão de células epiteliais de acordo com ciclos estrais ¹⁰ (Figura 1B, adulto).

Desde o início da gestação, o tecido mamário de crescimento sofre alterações morfológicas e importante para se preparar para a lactação. O epitélio mamário extensivamente proliferam e se diferenciam, levando a uma rede túbulo-alveolar altamente ramificada. Concomitantemente, as células epiteliais mamárias (SAMU) tornam-se polarizado e capaz de sintetizar e secretar produtos lácteos. MECs organizar-se em numerosas estruturas alveolares (acini) que são cercados por células mioepiteliais contráteis e incorporadas em um estroma composto por tecidos conectivos e adiposos, vasos sanguíneos e terminações nervosas (Figura 1B, a gravidez). Além disso, o lado basal de MECs está em estreito contato com a membrana basal (matriz extracelular), e as interações entre estas duas entidades com força regular tanto a função morfogênese e secretora do mammary epitélio ^11-13.

Todos estes processos dependem da acção de várias sugestões ambientais, das quais as mais importantes são hormones14, factores parácrinos e a matriz extracelular. Por exemplo, a progesterona induz extensa alveologenesis ^{15 e} que, em combinação com a prolactina (PRL) lateral ^{ramificando-16,17,} promove a diferenciação e mantém dos alvéolos. Em adição aos esteróides e PRL18, citoquinas e as vias de sinalização associadas ao desenvolvimento (Wnt e Notch vias de sinalização) também estão envolvidos em compromisso e desenvolvimento mamário linhagem ^19-21. No final da gravidez, as MECs luminais começar a produzir um leite rico em proteína conhecida como colostro no lúmen dos alvéolos. Além disso, a progesterona actua sobre a permeabilidade epitelial e uma vez que as junções apertadas são ainda aberta, colostro também é encontrado na corrente sanguínea da mãe.

Após o parto, a Mammary epitélio ocupa quase todo o volume da glândula mamaria e é altamente organizada (Figura 2, epitélio mamário). Unidades de produção de leite, nomeadamente alvéolos (Figura 2, alvéolo), são formadas por uma monocamada de células epiteliais mamarias secretórias polarizados (MESCs), com a sua membrana plasmática apical que delimita o lúmen. Alvéolos organizar-se em lóbulos que são agrupados em lobos ligados a condutas que drenam o leite para o meio exterior (Figura 2, lobo). Lactação ocorre, isto é., MESCs começar a secretar grandes quantidades de leite, provocados principalmente pela queda de hormonas da placenta (principalmente progesterona) (Figura 1B, lactação). Genes de proteínas do leite são activados de um curso de tempo variando temporais definido desde a gravidez até lactação ^9,22,23, principalmente em resposta a pituitária PRL libertado no momento da sucção. Concomitantemente, os contactos entre MESCs e da matriz extracelular tanto estimular a proteína do leite synthesis através de sinais que são mediadas através das interacções entre integrinas celulares e laminina ^24,25, e suprimir a apoptose em MESCs ^26,27. Estas vias de sinalização como resultado a activação de promotores de genes de proteínas do leite ²⁸ através da activação da transcrição de factores específicos ^29. Contatos célula-célula também são importantes para alguns aspectos de diferenciação, incluindo o estabelecimento de polaridade apical ea secreção vectorial de produtos lácteos. Tight junctions fechar rapidamente após o início da lactação e MESCs finamente orquestrar a absorção de moléculas a partir do sangue, bem como a síntese, o transporte e a secreção de componentes de leite, em resposta aos requisitos nutricionais dos recém-nascidos. No momento da sucção, a contracção das células mioepiteliais que rodeiam os alvéolos ocorre em resposta à oxitocina e leva a ejecção de leite através das condutas e para dentro do mamilo. O leite é um fluido que contém complexo de proteínas (principalmentecaseínas), açúcares (principalmente lactose), lípidos e minerais, assim como moléculas bioactivas, tais como imunoglobulinas A (IgA), factores de crescimento e hormonas. As caseínas são sintetizados, montados em estruturas supramoleculares, ou seja micelas de caseína, transportados ao longo da via secretora, e, em seguida, libertada por exocitose, isto é, a fusão de vesículas secretoras contendo caseína (SVS) com a membrana plasmática apical de MESC (Figura 2).

Tráfego intracelular depende de trocas materiais entre os compartimentos membranosos e envolve Solúvel N-etilmaleimida Sensitive Fusion (NSF) Protein Anexo (SNAP) Receptor (SNARE) ^30,31. A família de proteínas SNARE é subdividida em SNAREs vesiculares (v-SNAREs), presentes na membrana da vesícula, e laços alvo (t-armadilhas), localizadas nas membranas alvo. Ao fechar através dos seus domínios em espiral espiralada, V- e t-SNARE montar para formar um complexo de feixe de quatro hélices altamente estável, referido como thcomplexo e SNARE. Este complexo promove a fusão de duas camadas duplas lipídicas opostos gradualmente trazê-los em estreita proximidade ^30,32. Em seguida, os complexos SNARE são dissociados pelo triphosphatase adenosina NSF e suas proteínas SNAP e SNARE proteína adaptador são reciclados de volta ao seu compartimento de origem ^33. Interessantemente, cada proteína SNARE reside predominantemente em compartimentos celulares distintas e SNARE emparelhamento pode contribuir para a especificidade de eventos intracelulares de fusão ^34. Estudos anteriores sugerem que, pelo menos, Protein 23 (SNAP23) e vesículas com Associated proteína de membrana 8 (VAMP8), e syntaxins (STX) sinaptosomal Associada -7 e -12 desempenhar um papel na caseína exocitose ^35,36. Estas proteínas também foram encontrados em associação com a fracção lipídica de leite, isto é, gordura de leite (MFG glóbulos) ^37. O modelo predominante atual postula que gotículas lipídicas citoplasmáticas (CLDS) são formados pela acumulação de neutro lIPIDs (principalmente triacilgliceróis e ésteres de esteróis) e colesterol derivado da dieta materna entre os dois folhetos do retículo endoplasmático (ER) da membrana ^38-41. Grandes CLD são formados, pelo menos em parte, pela fusão de CLD menor enquanto está a ser transportado para o lado apical de MESCs onde eles são libertados como MFG (1-10 um de diâmetro) por germinação, sendo envolta pela membrana plasmática apical MESC ^40-42. Aleitamento cessa após os filhotes são desmamados e os MESCs morrem progressivamente por apoptose, levando à regressão do tecido mamário volta a um estado puberal (Figura 1B, involução).

Imunofluorescência (IF) é um método de laboratório analítico comum usado em quase todos os aspectos da biologia, tanto em pesquisas como em diagnósticos clínicos. SE técnicas podem ser realizadas em secções de tecido (imuno-histoquímica, IHC) ou imunocitoquímica (ICC), amostras de células. Esta poderosa abordagem baseia-se na utilização de fluorescent-anticorpos marcados que se ligam especificamente (directa ou indirectamente) para o antigénio de interesse, permitindo assim a visualização da sua distribuição nos tecidos através de microscopia de fluorescência. Principalmente sinais de fluorescência dependem da qualidade e concentração dos anticorpos e tratamento adequado da amostra. Um protocolo simples de imunofluorescência indirecta (IIF) é apresentada para detectar produtos de leite (caseínas e MFG) e proteínas envolvidas na secreção do produto de leite (butyrophilin (btn1), proteínas SNARE) em secções congeladas de tecido mamário de ratinho (Figura 3). Embora este protocolo fornece uma visão completa IHC, que vão desde coleta de tecido para a imagem de pós-tratamento, crítica e passos opcionais, bem como algumas recomendações técnicas também são apresentados e discutidos.

Protocol

Ratinhos CD1 foram criados pelo INRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, França). Todos os aspectos éticos de cuidados com animais cumprido com as orientações pertinentes e requisitos de licenciamento estabelecidos pelo Ministério da Agricultura francês. Os procedimentos utilizados foram aprovados pelo comitê de ética local (12/097 acordo do Comethea Jouy-en-Josas / AgroParisTech). 1. glândula mamária Preparação de Amostras Glândula mamaria do rato dissecção <…

Representative Results

A glândula mamária é uma glândula subcutânea localizada ao longo da estrutura de ambos ventral do tórax e do abdômen em roedores. A localização dos cinco pares de glândulas do rato durante a gestação é mostrado na Figura 4. A morfologia da glândula mamária muda dramaticamente durante o seu desenvolvimento, reflectindo modificações funcionais necessárias para preparar a plena lactação (Figura 1B). Em animais virgens ou nulíparas, a glân…

Discussion

IHC é um método experimental simples e relativamente simples para localizar antigénio em secções de tecido, o qual depende primariamente em interacções epitopo-anticorpo específicos. Embora um grande número de protocolos são utilizados para localizar uma proteína por IFI, a essência destes procedimentos é quase sempre o mesmo. No entanto, existem alguns aspectos críticos que podem influenciar fortemente o resultado e, por conseguinte, devem ser optimizadas para cada estudo IHC indivíduo. O maior desafio d…

Materials

Dissection	Company	Catalog Number	Comments/Description
Pins
Ethanol
Scissors
Scalpel and adapted blades
Ice
Towel paper
Tissue sample preparation	Company	Catalog Number	Comments/Description
Phosphate Buffered Saline (pH7.4)	Sigma	P-3813
Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)	Electron Microscopy Sciences	15714-S	personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer
OCT compound/Tissue Tek	Sakura	4583
Sucrose (D-saccharose)	VWR	27480.294
Plastic molds	Dominique Dutscher	39910
Liquid nitrogen
Cryostat/sample support	Leica	CM3050S
Razor blades (SEC35)	Thermo Scientific	152200
Slide box
Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus	Thermo Scientific	10143560W90/1014356190
Brushes
IHC	Company	Catalog Number	Comments/Description
Super Pap Pen	Sigma	Z377821-1EA
Permanent marker (black)
50 mM NH4Cl in PBS	Sigma	A-0171
0.1 M glycine in PBS	VWR	24403.367
Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6
Heater (up to 100°C)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7906-100G
Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI	Vector Laboratories	H-1000/H-1200
Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)	VWR	CORN2980-225
Nail polish
Primary antibodies	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)	generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences Center, USA)
Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)	Biolegend (Covance)	MMS-162P
Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)	Thermo Scientific	MS-115-P0/P1
Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)	generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)
Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)	generously gifted S. Tooze (Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)
Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)	Abcam	ab3348
Secondary antibodies	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-025-003
Counterstains	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bodipy 493/503	Life Technologies (Molecular Probes)	D-3922
DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)	Life Technologies (Molecular Probes)	D-1306
Observation/Image capture	Company	Catalog Number	Comments/Description
conventional fluorescence microscope	Leica Leitz DMRB microscope		Standard filters for FITC, Rhodamine and DAPI emissions,                     ×63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), CellˆF software (Olympus)
Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)	Zeiss LSM 510 microscope		Plan-Apochromat ×63 oil-immersion objective (NA 1.4),                  CLSM 510 software,               Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)
Image treatment	Company	Catalog Number	Comments/Description
ImageJ 1.49k software			Free software