アデノウイルスに感染したヒト正常細胞からのウイルス複製コンパートメントに富むサブ核画分の単離
Summary
We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.
Abstract
During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.
Introduction
アデノウイルスは、感染細胞の核内で複製する二本鎖DNAゲノムを含みます。ウイルスDNAは核に入ると、それは、PML核小体1に隣接して局在します。ウイルスの初期遺伝子発現に続いて、核アーキテクチャは劇的と呼ばれる、ウイルスの微小環境の形成を誘導し、再編成されたウイルス複製のコンパートメント（RC）2。アデノウイルス（AD）RCは、ウイルスゲノムの複製およびウイルス後期遺伝子の発現が起こる部位であるので、これらのプロセスに関与するすべての必要なウイルスおよび細胞因子の動員のための環境を提供します。興味深いことに、このようなDNA損傷応答等の細胞抗ウイルス応答を担う細胞タンパク質、種々の、先天性免疫応答および腫瘍抑制は、これらのウイルスの部位2に同時オプトインしています。同時に調整しながらしたがって、広告RCは、効率的なウイルス複製を促進する調節ハブを考慮することができますこれらの構造は、ウイルス – 宿主細胞の相互作用を理解するための鍵であることを示す細胞の抗ウイルス応答、。それにもかかわらず、RC形成の分子機構は、それらの組成および関連する活動があまり理解されていません。
核内で複製する他のDNAウイルスからのアデノウイルスのRCと同様に、RCが細胞質RC 3とは対照的に、膜に関連付けられていません。また、これらのウイルス誘発性構造は、タンパク質および核酸の完全に構成される可能性があります。 RNAウイルス（通常ウイルス工場と呼ばれる）に感染した細胞内に形成されたRCは、その詳細な形態的、機能的および生化学的特徴4が容易になったそれらの細胞質局在性および膜結合状態、を利用して、単離されています。
我々の知る限り、核ウイルスRCはおそらく核アーキテクチャの複雑さと核内メートルがないため、単離されていませんそれらの単離を容易にするであろうembranes。彼らの研究は、免疫蛍光顕微鏡、魚や透過型電子顕微鏡で代わりに依存してきました。しかし、核内構造体を単離することに固有の合併症にもかかわらず、このような核小体とカハール体として他の核ドメインが5,6の前に単離されています。核小体とRCの両方がタンパク質や核酸で構成され、0.5の間の直径持っているので – 5μmで、私たちは、RCはまた、分離に適してなければならないという仮説を立てました。そのため、より正確にはRCに関連する分子組成および機能を特徴付けるために、我々は、RCで強化された核内画分を単離するための新規な方法を確立しました。この目的のために、我々は核 小体7または他の核ドメイン6を単離するために使用される手順と同様の速度勾配およびスクロースクッションを使用して、サブ核画分を調製して、分子組成の研究との関連活動を可能にする無細胞系を確立しましたRC。この技術は、したがって、ウイルス – 宿主細胞相互作用の理解を進め、また、核内で複製する他のウイルスからのRCの詳細な分析を容易にし、アデノウイルス内に形成されたものと同様の寸法の複製区画の形成を誘導するはずである強力なツールを表しているべきですこのような、ヘルペスウイルス、パピローマウイルスまたはポリオーマウイルスなどの感染細胞、。
Protocol
Representative Results
Discussion
In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) and Promep-SEP for R.A.G.; P.H. received a scholarship from CONACyT (447442).
Materials
| DMEM | Gibco | 12100-046 | Warm in 37 ºC water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12484-028 | |
| Sucrose, Ultra Pure | Research Organics | 0928S | Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC |
| Dounce homogenizer | Kontess Glass Company | 884900-0000 | |
| Branson 1800 Ultrasonic Bath | Branson | Z769533 SIGMA | Turn on 15 min before use. |
| Peroxidase AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-036-003 | Use at a 1:10,000 dilution in PBS/0.03% non-fat milk |
| Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-21121 | Use at a 1:2,000 dilution in PBS |
| Silane-Prep Slides | Sigma | S4651-72EA | Open in a laminar flow cabinet |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce ThermoScientific | 34080 |
References
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