Summary

Präzise und Phenol Freie DNA Geschlechtsbestimmung von Tag 30 Schweineembryonen mittels PCR

Published: February 14, 2016
doi:

Summary

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Abstract

Die Erforschung pränatale Programmierung in das Schwein hat gezeigt, dass das Geschlecht des sich entwickelnden Embryo oder Fötus das Entwicklungsergebnis beeinflussen können. Daher ist die Fähigkeit, ein Embryo, das Geschlecht zu bestimmen, ist notwendig, viele Experimente besonders früh Entwicklung. Dieses Protokoll zeigt, eine kostengünstige, schnelle und nicht-toxische Herstellung von Schweine genomische DNA zur Verwendung mit PCR. Tag 30 Embryonen auf humane Weise den Richtlinien festgelegt nach durch Institutional Animal Politik und Wohlfahrtsausschüsse für das vorliegende Protokoll gesammelt werden müssen. Die Herstellung des gesamten Embryos für diese PCR basiert sexing Technik einfach beinhaltet die gefrorenen Embryos zu einem feinen Pulver Mahlen eines vorgekühlten Mörser und Pistill. PCR-Qualität-DNA wird aus einer kleinen Menge von Embryo Pulver freigesetzt durch eine heiße Inkubation in einem alkalischen Lyse-Reagenz aufgebracht wird. Als nächstes wird die DNA-Lösung mit Neutralisationspuffer gemischt und direkt für die PCR verwendet. Zwei Primerpaare erzeugt UVEKt bestimmte Geschlechtsbestimmungsbereich des Y-Chromosoms (SRY) und ZFX Bereich des X- Chromosoms mit hoher Genauigkeit und Spezifität. Das gleiche Protokoll kann auf andere längliche Embryonen (Tag 10 bis Tag 14) früher als Tag angewendet werden 30. Auch kann dieses Protokoll mit 96 quoll Platten durchgeführt werden, wenn eine große Anzahl von Embryos Screening, so dass es möglich für die Automation und Hoch Durchsatz Sex Typisierung.

Introduction

Das Hausschwein hat sowohl eine grundlegende Forschungsgegenstand in der Entwicklung, Genetik und Ernährung in den Bereichen Mensch und Vieh werden. Das Potential von Schweinen als biomedizinische Modelle für die Forschung mit menschlichen können, um ihre physiologischen Ähnlichkeiten zurückgeführt werden. In Nutztiere, kann die Manipulation von Geschlechterverhältnis, die Wirksamkeit der Selektion und Zuchtprogramme 1 erhöhen. Sexing einzelnen Embryonen ist ein grundlegendes Werkzeug in vielen experimentellen Untersuchungen verwendet, einschließlich, jedoch nicht zu Genotyp, Epigenetik und X-Inaktivierung von Geschlechtsunterschied in der frühen Embryonalentwicklung 2 beschränkt.

Studien an Mäusen legen nahe, dass mütterliche Ernährung und andere Faktoren in Geschlechterungleichgewicht 3 führen kann. Bei Schweinen Ursachen des Ungleichgewichts Geschlechterverhältnis sind väterlichen Zucht 4, Gebärmutter-Kapazität 5, und die Stoffwechsellage der Sau 6. Da die beobachteten Unterschiede in Embryonen und Würfe können durch an sich beeinflusst werdenxual Dimorphismus, sollten Forscher bewusst Embryo Sex und Geschlechterverhältnisse, bevor Rückschlüsse auf ihre Forschung zu ziehen. Die Entwicklung von leistungsfähigen Werkzeugen und Protokollen für die Geschlechtsbestimmung Schwein Embryonen an Tag 30 der Entwicklung werden hier diskutiert.

Verschiedene Methoden der Geschlechtstypisierung wurden für genetische Studien in Modellorganismen und Viehzucht entwickelt. Besonders in der Tierhaltung, frühen Embryonen männliche und weibliche Identifizierung ist eine sehr gängige Praxis genetische Selektion für Zuchtprogramme zu verbessern. Am frühen Embryonen in der Schweine Karyotypisierung mit Giemsa 7 oder die intensive Fluoreszenz 8,9 Techniken wurden für Sex Typisierung verwendet. Jedoch sind diese Verfahren zeitaufwendig und eignet sich nicht für das Screening einer großen Anzahl von Embryonen schnell und genau.

Die effektivste Methode ist, sex Typisierung DNA-Amplifikation eine hitzestabile DNA-Polymerase und zwei Primern. DNA-Geschlechtsbestimmung durch PCR-Methode ist präziser, schneller und empfindlicher, our erfordert eine winzige Menge von Schaumstoffen. Die erste PCR-basierte Embryo Geschlechtsbestimmung wurde am 10. Menschen durchgeführt und später in Mäusen 11, Rinder 12, Büffel, Schafe 13 14 pre-Implantation-Embryonen. Beim Schwein wurde der früheste DNA Sex Typisierungsmethode für Präimplantationsembryonen etabliert über ein einziges Paar von Y-Chromosom-spezifischen DNA-Primer 15. Jedoch waren die häufigsten PCR-Primer für die Geschlechtsbestimmung von dem Y-Chromosom der männlichen spezifischen Gens SRY 16 ausgewählt, und der nicht-geschlechtsspezifischen diskriminierende Bereich einer Zinkfinger-Gen an beiden X und Y-Chromosom 17 befindet. Anschließend wurden diese Primer wurden in dieser Studie mit verbesserter Spezifität der Primer zu erfassen nur die X- Chromosom eines Zinkfinger-Gen, das Geschlecht Tag 30-Embryonen zu bestimmen aufgetragen.

Genomische DNA aus Schweine Präimplantationsembryonen kann durch Belichten eines intakten Blastozyste mit proteinas zum Puffern extrahiert werdene K 16 oder durch eine Biopsie von wenigen Zellen aus den einzelnen frühen Spaltung unter Embryonen 15 und für direkte PCR. Jedoch Freisetzung von DNA aus Schweineblut, Haare, Gewebe oder einem großen conceptus über einige Zentimeter groß ist nicht effektiv getan, um die Proteinase K-Methode. DNA-Extraktionsverfahren für diese Materialien wurden 18 entweder zeitaufwendig Phenol / Chloroform-Protokolle 6 oder teuer Spalte basiert Kits hergestellt. Um die Verwendung von potentiell toxischen Chemikalien zu vermeiden, gibt es einen Trend kostengünstig, einfach und phenolfrei DNA Extraktionsverfahren zu entwickeln. Diese Art von Protokoll für die Isolierung von PCR-Qualität genomische DNA von der Maus 19 und Zebrafisch 20 Geweben wurde unter Verwendung von heißem Natriumhydroxid und Tris (HOTSHOT) etabliert. Diese Studie liefert ein Protokoll DNA mit modifizierten Hotshot und neu gestaltet Duplex Primerpaare für die PCR-Sex Eingabe direkt aus Zelllysaten von Tag 30 Schweineembryonen zu erhalten mithohe Genauigkeit.

Protocol

In Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care-Richtlinien und mit Zustimmung der Fakultät Tierpolitik und Wohlfahrtsausschuss – Viehzucht von der University of Alberta, wurden trächtige Sauen durch geschultes Personal bei ungefähr Tag eingeschläfert 30 der Schwangerschaft und Embryonen wurden gesammelt. Verwenden Untersuchungshandschuhen jederzeit im Verlauf der Verfahren. 1. Probenentnahme und Probenlagerung Euthanize Sau mit durch Ausbluten gefolgt Bolzen. Tragen Untersuchungshands…

Representative Results

Ein repräsentatives Ergebnis der Geschlechtsbestimmung von 345 DNA Lysaten Screening mittels PCR ist in Abbildung 7 und zusammengefasst in Tabelle 1 dargestellt. Wie bei 65 ° C in Figur 7 ist der Primer Glühtemperatur sehen ist, ist die optimale Bedingung in diesem PCR-Protokoll ähnliche Intensität und prädizierten Amplikongrößen erzeugen (Figur 5) zwi…

Discussion

Die meisten der bestehenden Protokolle im Zusammenhang mit Schweineembryonen DNA Sex Typisierung sind nur für den frühen Stadium vor der Implantation Stufe 15,16. Wir haben erfolgreich ein Protokoll für Schweineembryos Screening während der späten Schwangerschaft entwickelt. Basierend auf Studien mit ähnlichen Entwicklungsstadien von Embryonen aus früheren Studien 6,18 ist die vorliegende Protokoll als sicherer und kostengünstig zu sein.

Dieses Protokoll ist fü…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten die Zusammenarbeit und die finanziellen Beiträge der folgenden Forschungsförderorganisation zu bestätigen: Alberta Vieh und Fleisch-Agentur GmbH, Schweinefleisch CRC, Alberta Pork, Hypor A Hendrix Genetics Company und NSERC CRSNG.

Materials

KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit  KAPABiosystems KR0370 other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization
SYBR Safe DNA Gel Stain Life Technologies S33102 Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe
Pig female and male genomic DNA Zyagen GP-160-F1 & GP-160-M5 Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.
Typhoon FLA 9500 laser scanner GE Healthcare Life Sciences 28-9969-43 other imaging system can be used
Free Soft Nitrile Examination Gloves WWR 89038-270 any other examination glove can be used
Sodium hydroxide, solid  Fisher BP 359 -212 Molecular Biology Grade
Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean Eppendorff 0030 108.051 heat resistant
ThermoStat plus Eppendorff 22670204 Use as a incubator for 95C, don't need to use the heater
Toothpick Bunzl Plc 75200815 Any round wooden toothpicks can be used – quality wood
Microcentrifuge 5417R/5417C Eppendorff 22621807 This model was discontinued. But another newer model can be used
Microspatula Fisher SDI28540115 Autoclaved before use each time.

References

  1. Seidel, G. E. Economics of selecting for sex: the most important genetic trait. Theriogenology. 59, 585-598 (2003).
  2. Gutiérrez-Adán, A., et al. Development consequences of sexual dimorphism during pre-implantation embryonic development. Reprod. Domest. Anim. 41, 54-62 (2006).
  3. Rosenfeld, C. S., Roberts, R. M. Maternal diet and other factors affecting offspring sex ratio: a review. Biol Reprod. 71, 1063-1070 (2004).
  4. Gorecki, M. T. Sex ratio in litters of domestic pigs (Sus scrofa f. domestica Linnaeus, 1758). Biol. Lett. 40, 111-118 (2003).
  5. Chen, Z. Y., Dziuk, P. J. Influence of initial length of uterus per embryo and gestation stage on prenatal survival, development, and sex ratio in the pig. J. Anim. Sci. 71, 1895-1901 (1993).
  6. Vinsky, M. D., Novak, S., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Foxcroft, G. R. Nutritional restriction in lactating primiparous sows selectively affects female embryo survival and overall litter. Reprod. Fertil. Dev. 18, 347-355 (2006).
  7. Cassar, G., King, W. A., King, G. J. Influence of sex on early growth of pig conceptuses. J. Reprod. Fertil. 101, 317-320 (1994).
  8. Zudova, D., Rezacova, O., Kubickova, S., Rubes, J. Aneuploidy detection in porcine embryos using fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 102, 179-183 (2003).
  9. Hornak, M., Oracova, E., Hulinska, P., Urbankova, L., Rubes, J. Aneuploidy detection in pigs using comparative genomic hybridization: from the oocytes to blastocysts. PLoS One. 7, (2012).
  10. Handyside, A. H., Pattinson, J. K., Penketh, R. J., Delhanty, J. D., Winston, R. M., Tuddenham, E. G. Biopsy of human preimplantation embryos and sexing by DNA amplification. Lancet. 1, 347-349 (1989).
  11. Wilton, L. J., Shaw, J. M., Trounson, A. O. Successful single-cell biopsy and cryopreservation of preimplantation mouse embryos. Feri. Steril. 51, 513-517 (1989).
  12. Peura, J. M., Turunen, M., Janne, J. A reliable sex determination assay for bovine preimplantation embryos using the polymerase chain reaction. Theriogenology. 35, 547-555 (1991).
  13. Rao, K. B., Pawshe, C. H., Totey, S. M. Sex determination of in vitro developed buffalo (Buhalus buhalis.) embryos by DNA amplification. Mol. Reprod. Dev. 36, 291-296 (1993).
  14. Herr, C. M., Matthaei, K. I., Petrzak, U., Reed, K. C. A rapid Y-chromosome-detecting ovine embryo sexing assay. Theriogenology. 33, 245 (1990).
  15. Fajfar-Whetstone, C. J., LaneRayburn, A., Schook, L. B., Wheeler, M. B. Sex determination of porcine during preimplantation embryos via y-chromosome specific DNA sequences. Animal Biotechnology. 4, 183-193 (1993).
  16. Pomp, D., Good, B. A., Geisert, R. D., Corbin, C. J., Conley, A. J. Sex identification in mammals with polymerase chain reaction and its use to examine sex effects on diameter of day-10 or -11 pig embryos. J. Anim. Sci. 73, 1408-1415 (1995).
  17. Aasen, E., Medrano, J. F. Amplification of the ZFY and ZFX genes for sex identification in humans, cattle, sheep and goats. Biotechnology (N Y). 8, 1279-1281 (1990).
  18. Oliver, G., et al. Restricted feed intake in lactating primiparous sows. II. Effects on subsequent litter sex ratio and embryonic gene expression. Reprod Fertil. Dev. 23, 899-911 (2011).
  19. Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R. L., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29, 52-54 (2000).
  20. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish embryos. Biotechniques. 43, 610-614 (2007).
  21. Almeida, F. C. R. L., Machado, G. S., Borges, A. L. C. C., Rosa, B. O., Fontes, D. O. Consequences of different dietary energy sources during folliculardevelopment on subsequent fertility of cyclic gilts. Animal. 8, 293-299 (2014).
  22. Foxcroft, G. R., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Novak, S., Harding, J. C. S., Almeida, F. C. R. L., Rodriguez-Martinez, Prenatal programming of postnatal development in the pig. Control of Pig Reproduction VIII. , 212-213 (2009).

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Blanes, M. S., Tsoi, S. C., Dyck, M. K. Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR. J. Vis. Exp. (108), e53301, doi:10.3791/53301 (2016).

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