細胞内のCaの蛍光と生物発光イメージング²⁺高齢者における海馬ニューロン

Summary

Intracellular Ca²⁺ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca²⁺ overload. We aimed at investigating Ca²⁺ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca²⁺ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Abstract

神経変性および虚血に関連する神経細胞死に対する感受性は非常に高齢の脳で増加しているが、原因となるメカニズムはひどく知られています。興奮毒性、両方の傷害により誘発されるニューロン損傷に寄与すると考えプロセスは、 ^の Ca 2+流入およびミトコンドリア^の Ca 2+過負荷を促進するグルタミン酸受容体の活性化によって媒介されます。 ^細胞内Ca 2+恒常性の^細胞内Ca 2+ホメオスタシスや改造の実質的な変化は、古いニューロンにおけるニューロン損傷を好むことがあります。老化中のCa ²⁺リモデリングを調査するために、我々 は 、in vivoでの神経細胞を老化させ、いくつかの態様で似ているラット海馬神経細胞の長期培養でのライブセルイメージングを使用しています。このために、海馬の細胞は、最初の場所で、新鮮に生まれたばかりのラットの海馬から分散され、ポーリ-D-リジンコーティングされ、カバーガラス上にプレーティングしました。その後、培養物は数日または数ワットのために制御されるメディアに保管されていますそれぞれ、老若男女ニューロンを調査するためeeks。第二に、培養されたニューロンはFURA2にロードされ、デジタル蛍光比イメージングを使用して、細胞質ゾル^Ca 2+濃度の測定を行っています。第三に、培養神経細胞は、ミトコンドリアを標的とする低親和性エクオリンとGFPのタンデムを発現するプラスミドでトランスフェクトされます。 24時間後、細胞内でエクオリンはセレンテラジンを用いて再構成され、神経細胞は、ミトコンドリアのCa ^2+濃度を監視するための生物発光イメージングに供します。この3段階の手順としては、例えば、細胞質ゾル、関連刺激に対するミトコンドリアのCa ^2+応答のモニタリングを可能にするグルタミン酸受容体アゴニストNMDAこれら及び他の応答は、加齢によって影響を受けるかどうかを比較します。この手順では、どのように影響を与える細胞質とミトコンドリアのCa ²⁺選択刺激に対する応答だけでなく、神経細胞を防止することを目的とし選択される薬剤のエージング試験のように、新しい洞察をもたらすことができます加齢関連疾患で死亡。

Introduction

興奮毒性は、虚血などの神経学的傷害であり、例えば、アルツハイマー病の¹などのいくつかの神経変性疾患における神経損傷および細胞死に寄与する最も重要な機構の1つです。神経毒性のこのタイプは、主にカルシウムに作用するグルタメートにより媒介される²⁺ -permeable、イオンチャネル型NMDA受容体^{（NMDAR）2。}グルタミン酸への培養神経細胞の曝露は、神経細胞のアポトーシス^{4を引き起こす}興奮毒性^3、につながることができます。我々と他の人は、以前、NMDA誘導性アポトーシスに対するニューロンの脆弱性は、in vitroでの開発と^5-8の加齢に変更される可能性があることを報告しています。

これは、広く細胞質ゾルのフリー^Ca 2+濃度（の[Ca ^2+] _CYT）の増加は、細胞の活性化につながることが認められています。この上昇は高すぎ、および/ ​​または十分に持続する場合には、それは細胞死^9をトリガすることができます。また、提案されていますその興奮毒性は、ミトコンドリアのCa ²⁺取り込み^10、グルタミン酸誘発細胞死¹¹に対するミトコンドリア脱共役保護ニューロンとニューロンの治療以降が必要です。ミトコンドリアはあまりにも多くのCa ^2+を取る場合は、ミトコンドリア膜透過性遷移孔の開口部は、シトクロムcおよび他のプロアポトーシス因子の放出、およびアポトーシスを誘導につながる、発生することがあります。私たちは最近、このミトコンドリアのCa ²⁺取り込みを直接直接単一海馬ニューロン⁵におけるNMDA誘発性のミトコンドリアのCa ²⁺取り込み、この記事で報告されているメソッドを測定することにより、興奮毒性の年齢依存性の感受性に関連していることが示されています。このような学習、記憶およびその他の認知プロセス¹²のような生理学的プロセスに関与する海馬は、加齢と神経変性疾患¹³に対して非常に脆弱です。これは、 インビトロで数週間後、ことが提案されている、培養海馬ニューロンは、高齢者のニューロン¹⁴の典型的な特徴の数を示します。したがって、長期培養海馬神経細胞は老化で強化された興奮毒性の^の Ca 2+媒介メカニズムを調査するための包括的なモデルを提供することができます。

提示された方法の全体的な目的は、長期培養海馬ニューロンにおけるNMDA受容体アゴニストによって誘発される差動^の Ca 2+応答を含む老化脳における^細胞内Ca 2+ホメオスタシス又はCa ²⁺リモデリングの実質的な変化を調査することです。この方法は、それぞれ、ラット海馬ニューロンの培養物の詳細な説明及び個々のニューロンにおける蛍光および生物発光イメージングによる細胞質ゾルおよびミトコンドリア^の Ca 2+濃度のモニタリングを含みます。培養神経細胞における細胞質ゾルのCa ²⁺の蛍光イメージングは、標準的な手順です。しかし、この方法は、サブのための信頼性が低いですミトコンドリアのCa ²⁺を含む細胞のCa ²⁺測定。この理由も、mMのレベルに低μMレベルからミトコンドリアで変更される可能性のCa ²⁺濃度のための合成プローブの適切な標的と不適切な親和性の欠如を含みます。インスタンスエクオリンのようなタンパク質に基づいたCa ²⁺プローブの使用は、細胞内小器官への標的化し、特定のCa ²⁺結合部位^15を欠く異なるセレンテラジンまたは変異プローブを用いて、異なる誘導体のCa ²⁺親和性の使用を許可されています。このように、ミトコンドリア標的エクオリンを発現する細胞の生物発光イメージングは、個々の神経細胞におけるミトコンドリア^の Ca 2+濃度のモニタリングを可能にすることができます。しかし、この手順では、生物発光イメージングのために^16-18光子計数カメラや超CCDカメラの使用を必要とするかもしれません。この方法は、よりestablに確認すべきである小説の結果を得ることが脳の老化のモデルは古い動物から、例えば、脳スライス、としてished。

Protocol

倫理声明：動物を対象とする手順は、欧州条約123 /欧州評議会と指令609分の86 / EECに一致バリャドリッド大学動物飼育施設によって承認されたプロトコルの下で処理されました。 ラット海馬ニューロンの1短期・長期の文化ポリ-D-リジンの製造は、12 mmのガラスカバースリップコーティング。 少なくとも24時間、エタノール中に直径12mmのガラスカバースリップを滅菌し?…

Representative Results

ここでは、高齢者の神経細胞での[Ca 2+]のCa 2+改造および細胞質とミトコンドリアのNMDAの効果を評価するための簡単な方法を説明する。 図1は、新生ラット海馬神経細胞の単離および培養するための手順の概略を示しています。開始する前に、我々は、無菌の、ポリ-D-リジンコート、カバーガラスを準備し、4ウェルディッシュでそれらを検索する必要があります。…

Discussion

細胞内Ca ²⁺の改造老化脳内の恒常性は、認知喪失に関係しているが、虚血性損傷、興奮毒性および神経変性に対する感受性を増加させました。 in vitroでこの仮説を調べるために、のCa ²⁺イメージング手順が用意されています。残念ながら、古い海馬ニューロンの生存可能な培養物は、信頼性がありません。最近では、ROSの蓄積、リポフスチン顆粒の形成、ヘテロ病巣、pJ…

Materials

Neurobasal Culture Medium	Gibco	21103-049
HBSS medium	Gibco	14170-088
Ham's F-12 medium	Gibco	31330-038
DNase I (from bovine pancreas)	Sigma	D5025-15KU
Fetal Bobine Serum	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
Gentamicin	Gibco	15750
L-glutamine	Gibco	25030-032
12 mm glass coverslips	Labolan	0111520/20012
Papain	Worthington	LS003127
4-well multidish plaques	Nunc	176740
Petry dishes	JD Catalan s.l.	2120044T
Sterile pipettes	Fisher Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies	F1201
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
Coelenterazine n	Biotium	BT-10115-2250 uG
Digitonin	Sigma	D5628
NMDA	Sigma	M3262
Glycine	Sigma	50046
Zeiss Axiovert S100 TV microscope	Carl Zeiss Inc.
Xcite ilumination system	EXFO
ORCA ER fluorescence camera	Hamamatsu
VIM photon counting CCD camera	Hamamatsu
VC-8 valve controller	Warner Instruments
SH-27B heating system	Warner Instruments
Aquacosmos Software	Hamamatsu Photonics