Лазерным наведением нейронов в головном мозге Трассировка Экспланты
Summary
Мы описываем технику, чтобы маркировать нейроны и их процессы с помощью Антероградный или ретроградная трассирующих инъекций в ядрах головного мозга с использованием препарата в пробирке. Мы изменили существующий метод из п я пробирке трассирующими электропорации, воспользовавшись флуоресцентно меченного мутантов мыши и основную оптического оборудования с целью повышения точности маркировки.
Abstract
Мы представляем технику, которая сочетает в себе пробирке протокол в трассирующими впрыска, которая использует серию электрических импульсов и давления, чтобы увеличить поглощение красителя через электропорации в мозг эксплантов с целевой лазерной подсветки и соответствующих фильтров очки во время процедуры. Описанная методика электропорации в пробирке по себе дает относительно хорошее визуальное управление для таргетинга определенные участки мозга. Объединив его с лазерным возбуждением люминесцентных генетических маркеров и их чтения через фильтр очки группы обход, который может забрать выбросов генетически меченых клеток / ядер и красителя трассировки флуоресцентного, исследователь может существенно повысить точность инъекций находя интересующую область и контроля за распространением красителя / поглощения в области инъекции гораздо более эффективно. Кроме того, этот метод лазерного излучения позволяет исследовать функциональные возможности данного neurocircuit по провiding информацию о типе нейронов, в определенной области в тех случаях, когда выражение GFP связана с типом передатчика, выраженного субпопуляции нейронов.
Introduction
Для того, чтобы определить определенный нейронов (микро) схема, надо начать с поиска различных участников указанной схеме, и их способа подключения. С тех пор, публикация Уоллера о neurofiber трассировки через lesioning 1 большое разнообразие методов нейроанатомической трассировки был создан. Некоторые из этих методов может быть применен в фиксированной ткани вскрытии 2-4, другие полагаются на активном переносе красителя в живых нейронов, а обнаружен в 1971 5-6. Последнее может быть далее подразделены на две группы различения методов воспользовавшись активного ретроградный (от введенного области к источнику заданной проекцией, т.е.. В somata нейронов, которые проецируют на указанный участок) и активным антероградную (от вводят площадь к цели в данной проекции, то есть. аксонов прогнозов и аксонов терминалов меченых нейронов) транспорта. Кроме того, в некоторых случаях TRACER материал вводят в живых животных, которые затем пережить инъекции несколько дней или недель (в естественных условиях трассирующих инъекций), в то время как в других случаях вводят эксплантированных мозги и инкубировать в течение нескольких часов после инъекции в области искусственного спинномозговой жидкости (в пробирке трассирующими инъекции) ,
В этом протоколе мы изменили существующий в пробирке техники электропорации 7-8 маркировать нейронов somata и процессы в Антероградный и ретроградной трассировки экспериментов с использованием choleratoxin субъединицы-б и тетраметилродамин декстран как след веществ. Общая цель этого протокола состоит в обеспечении нейрофизиологов с эффективным инструментом, чтобы проследить закономерности нервных подключения между различными ядрами головного мозга, в то время как воспользовавшись доступных трансгенных линий мышей и основной оптического оборудования с целью повышения точности ориентации во трассирующих инъекций. Хотя метод Антероградный и ретроградной трассировки с помощьюcholeratoxin и декстран амин и их соответствующие флуоресцентно меченных конъюгатов не нова 9-13 (как это метод электропорации, например. Хаас и др. 14), сочетание индикаторных инъекций с электропорации в подготовке в пробирке с участием блоков ткани головного мозга является более недавнее развитие 7. Основное преимущество над методами нейронных трассировку и тот же тип меченых красителей в живых животных является увеличение интенсивности маркировки, из-за более высокой эффективности, с которой электропорации краситель быть занимаемого нейронов. Дополнительным преимуществом является укороченный инкубационный период (необходимое для транспортировки красителя) и его повышенная точность целевого во время инъекции трассирующей, потому что экспериментатор визуальный контроль над целевой области инъекции. Последнее также означает, что нет дороже стереотаксической оборудование не требуется, чтобы найти ядро или мозга сферу интересов.
Для дополнинально повысить адресности, мы воспользовались трансгенной линии мышей, которая выражает GFP в глицинергических субпопуляции нейронов 15 и основной оптического оборудования, состоящих из ручного лазерного указателя 405 нм фильтрации длины волны и соответствующий полосовой очки (450 – 700 нм). Таким образом, мы достигли значительного дальнейшего увеличения ориентации точность путем идентификации области инъекции через флуоресцентного сигнала и обеспечивая более тонкую способ управления для распространения красителя в зоне впрыска путем наблюдения за взаимодействием между сигналом коренного GFP и индикатором флуоресценции. Наша методика позволяет также раскрыть функциональность схеме вместе с его подключения путем выявления GFP-положительных тормозящих нейронов (или возбуждающих в других линий мышей), которые были заполнены с индикатора.
В целом, мы усиливается мощный инструмент Нейрологическая изучать Коннектом позвоночных мозг и оценки тон разные нейроанатомические особенности данной neurocircuit. С помощью трансгенных мышей наряду с недорогой и широко доступный оптического оборудования мы смогли значительно увеличить точность ориентации наших инъекций. Кроме того, трансгенные мыши, позволили нам определить тип прослеженных соединений, которые помогли раскрыть функциональность тормозного микросхемы в слуховой мозга.
Protocol
Representative Results
Discussion
Общая численность в пробирке индикаторного электропорации, в отличие от исследований в естественных условиях отслеживания, является то, что дает исследователям лучше доступ к области мозга интерес и, следовательно, не предполагает дорогостоящего стереотаксической (и часто …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддерживается NIH / NIDCD R01 DC эксперименты 011582. визуализации были проведены в университете Колорадо Anschutz Medical Campus Расширенный световой микроскопии Ядра при частичной поддержке NIH / NCRR Колорадо аст номер гранта UL1 RR025780 и расстройств Скалистые горы Neurlogical Core Center Грант NIH P30NS048154. Д-р Саша дю Лак из Института Солка предоставил нам мышей GlyT2-GFP.
Materials
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
References
- Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
- Fink, R. P., Heimer, L. Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system. Brain Res. 4, 369-374 (1967).
- Nauta, W. J. Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system. Stain Technol. 27, 175-179 (1952).
- Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l’Homme et des vertébrés. , (1911).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon. Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Retrograde axonal transport of protein. Brain Res. 29, 363-365 (1971).
- Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways. J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).
- Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance. J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers. Brain Res. 223, 381-385 (1981).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP. Brain Res. 231, 33-50 (1982).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect. Brain Res. 1240, 87-95 (2008).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats. Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).
- Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons. Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Heintz, N. Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research. Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy. J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).
- Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse. Front. Neural Circuits. 8, 83 (2014).
- Benson, D. A., Teas, D. C. Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla. Brain Res. 103, 313-338 (1976).
- Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera). Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).
- Ryan, A. Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Zwicker, E., Fastl, H. . Psychoacoustics Facts and Models. , (1990).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).
- Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains. J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
