Поколение и культура крови вырост эндотелиальных клеток из периферической крови человека

Summary

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Abstract

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

Introduction

До недавнего времени, послеродовой поколение новых кровеносных сосудов считалось происходить исключительно через процесс, известный как ангиогенез, определяется как прорастание новых сосудов из эндотелиальных клеток уже существующих сосудов. ¹ Этот процесс контрастирует с васкулогенеза или де Ново образование кровеносных сосудов из эндотелиальных клеток-предшественников, которые, как считалось, происходит исключительно в процессе эмбриогенеза. ² Тем не менее, более поздние исследования идентифицировали и выделили циркулирующие эндотелиальные клетки-предшественники (ЕРС) в периферической крови взрослых. Эти клетки обладают способностью дифференцироваться в зрелые эндотелиальные клетки в культуре и, как полагают, участвуют в послеродовой васкулогенеза. ^3,4

Протоколы для изоляции и расширения этих ЕРС обычно включают культуру мононуклеарных клеток периферической крови (PBMNCs) в среде, содержащей эндотелиальные факторы роста, в том числе vasculAR-эндотелиальный фактор роста (VEGF) и фактор роста фибробластов-2. ^5-8 культуры EPC производить различные резко различных типов клеток. Исходные культуры (<7 дней) преобладают моноцитов типа клеток, известной в литературе как "ранних" ЕРС. Несмотря на свое название, эти клетки выразить моноцитов маркер CD14, отрицательные для маркера предшественников CD34 и выразить только минимальные уровни классической маркеров эндотелиальной CD31 и VEGF рецептора 2 (VEGFR2). ⁵ Продолжение культура порождает вторичный популяции клеток, известный как вырост конце ЕРС или вырост крови эндотелиальных клеток (BOECs), которые появляются, как сдержанный колонии эндотелиальных клеток, как. В отличие от ранних моноцитарных ЕРС, BOECs, которые также называют эндотелиальные колониеобразующих клеток (ECFCs), эндотелиальные клетки вырост или поздно вырост эндотелиальные клетки, проявляют морфологию булыжника, что характерно для эндотелиальных клеток монослоя и очень похожи на поверхности маркера5 и экспрессия генов ^9, чтобы созреть эндотелиальные клетки.

Генерирование эндотелиальных-подобных клеток из периферической крови имеет ряд преимуществ, в частности, для изучения дисфункции эндотелиальных клеток, связанного с сосудистыми расстройствами, такими как легочной артериальной гипертензии (ЛАГ) ¹⁰ или болезнью Виллебранда. ¹¹ До наличия BOECs, эндотелиальной клетки могут быть получены только из эксплантированных органов на момент смерти или трансплантации органов или изолированные от пупочной вены при рождении. Это снижение доступности представляет собой серьезное ограничение с пониманием биологии эндотелиальных клеток у пациентов с сердечно-сосудистыми расстройствами, а также взаимодействия между эндотелиальными клетками и клетками крови либо или настенной клеток. Кроме того, выделение и культивирование чистую популяцию клеток эндотелия из этих источников является технически сложным и клетки, полученные с помощью этих методов обладают лишь Limiteд пролиферативный потенциал. Поэтому BOECs предложить ценный суррогат для изоляции и культуры первичных клеток пациента эндотелиальных происхождение.

В дополнение к их применения в пробирке, BOECs также являются потенциально полезными в аутологичных клеток трансплантации терапии. Эти приложения включают в себя как трансплантация клеток эндотелия для продвижения новых сосудов (см ^{12 и} ссылки в нем), а также генерацию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). ¹³ BOEC-полученные иПСК могут быть использованы для моделирования заболеваний и предлагают огромный потенциал в качестве исходного Материал для аутологичных клеток терапии. BOECs перепрограммировать быстрее и с большей эффективностью, чем фибробластов кожи. Кроме того, BOECs также позволит для генерации ИПСК, которые свободны от КАРИОТИПИЧЕСКУЮ аномалий, который является неотъемлемой чертой любой технологии, которая подойдет для трансляционных приложений. Способность генерировать ИПСК из образца крови пациента аLSO устраняет необходимость в биопсии кожи и образование фибробластов кожи, тем самым облегчая генерацию клеток от пациентов с заживлением ран расстройств, или очень молодые.

Протокол подробно ниже, утвержденным и проводится в соответствии с руководящими принципами Национального комитета по этике научных исследований службе (Восточная Англия), обеспечивает простой и надежный способ для генерации BOECs с более чем 90% эффективности от относительно небольшого объема (60 мл) периферической крови. Эти клетки обладают высокой пролиферативной и может быть повторно пересевают, позволяя для генерации сотни миллионов клеток из одной пробы крови.

Protocol

Схема протокола BOEC поколения показана на рисунке 1. 1. Кровь Сбор и центрифугирования в градиенте плотности Для каждого донора, добавить 3 мл раствора цитрата натрия к каждому из двух конических 50 мл центрифужные пробирки. Сбор 60 мл крови из вены и добавить 30 мл в каждую пробирку. Обратить мягко 2-3 раза перемешать. Используйте как 40 мл крови в протоколе, с объемами цитрат соответствующим образом скорректированы. Примечание: Очень важно, чтобы образцы крови обрабатываются в течение 2 ч сбора. Задержка обработки результатов крови в существенному сокращению в вырост выход колоний. Подготовка новых конические пробирки, содержащие центрифугирования в градиенте плотности среды сначала перевернув бутыль несколько раз перемешать. В стерильных капот, добавьте 15 мл центрифугированием в градиенте плотности среды в 50 мл коническую пробирку (трубку 1 на каждые 10 мл крови, 6 труб в донора). Развести крови 1: 1 с фосфатом Дульбекко-Buffered Соленая (DPBS). Наклоните пробирку, содержащую центрифугирования в градиенте плотности среды до угла 20 ° с рабочей поверхности. Использование помощи пипетки и 25 мл серологической пипеткой медленно слой 21 мл разбавленной крови в верхней части среды, постепенно добавляя кровь вниз к стенке трубки наклонной. Примечание: Это позволит свести к минимуму перемешивание крови с градиентом плотности слоя и будет производить более плотное поглощающее покрытие, а также улучшенную выход. Центрифуга образцов при 400 мкг в течение 35 мин при комнатной температуре с ускорителем и вынул. В течение этого периода центрифугирования, начать коллагена покрытие, описанную в шагах 2.1 – 2.4. Убедитесь, эти шаги были завершены, прежде чем приступить к шагу 3.1. 2. Коллаген Покрытие Т-75 колбу и подготовки питательной среды ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги в капот культуре клеток. Подготовка 50 мкг / мл раствора коллагена путем разбавления акции Tyре коллагена в 10 мл 0,02М уксусной кислоты. Пример: для коллагена складе в концентрации 4,05 мг / мл, добавляют 123,5 мкл коллагена 10 мл 0,02 М уксусной кислоты. Стерильный фильтр коллагена подвески перед использованием. Использование серологических пипетки, добавьте 7,5 мл раствора коллагена в культуре клеток колбу Т-75. Этот объем дает 5 мкг коллагена / см 2 (или 375 мкг / колбу). Шерсть колбу в течение 1 часа при комнатной температуре. Подготовка эндотелиальных среду роста, используемый для BOEC поколения, дополняя эндотелия базальной среды дополнений фактора роста, предоставляемых производителем. Добавить все добавки, но не добавлять сыворотку. Для приготовления 15 мл среды BOEC поколения, добавить 2,5 мл определенного фетальной бычьей сыворотки (FBS) до 12,5 мл эндотелиальных среды роста, содержащей добавки фактора роста. Продолжайте действия, описанные в разделе 3. После периода покрытия 1 час, аспирации раствора коллагена и смыть остаточных уксусной кислоты с помощью пипеткив 10 мл DPBS. Аспирируйте от DPBS и повторить этот шаг мыть еще раз. Если полученной клеточной суспензии во время этапа 3.3 не готов для посева в это время, добавьте 5 мл среды BOEC поколения в колбу, чтобы сохранить коллагена покрытие от высыхания. 3. Сбор и покрытие из PBMNCs После центрифугирования в градиенте плотности указано в пункте 1.4, тщательно собрать Баффи пальто слой, используя стерильный пластиковый пипетки передачи. Сбор и светлый сгусток должен давать примерно 20 мл суспензии клеток и плазмы из каждой пробирки. Избегайте передачи градиента плотности среды. Развести подвеску мононуклеарных клеток 1: 1 в DPBS и инвертировать перемешать. Центрифуга при комнатной температуре в течение 20 мин при 300 х г с тормозом и ускорителем на максимум. После центрифугирования, аспирация супернатант и ресуспендирования клеток путем добавления 1 мл среды BOEC поколения на каждую гранулу и пипетки вверх и вниз несколько раз. Бассейн клеточные суспензиид долить общий объем до 10 мл с оставшейся среде. Чтобы получить оценку общего числа клеток, образец 10 мкл клеточной суспензии и разбавленной 50x с 490 мкл раствора Турка, которые будут лизировать красные кровяные клетки. Граф 10 мкл образца разведенной суспензии клеток с использованием гемоцитометра. ПРИМЕЧАНИЕ: 60 мл крови должно дать около 100-150 х 10 6 белых кровяных клеток для обшивки. Пластина подвески все клетки в единую коллагена покрытием Т-75 колбу, пополнить объем среды 15 мл, чтобы / колбу и культуры при 37 ° С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO 2. Клетки высевали в это время представляют проход 0. ПРИМЕЧАНИЕ: Можно заморозить изолированных PBMNCs до BOEC изоляции для того, чтобы вывести на BOECs на более позднее время или для того, чтобы транспортировать PBMNCs в другой лаборатории, где BOECs могут быть сформированы. Тем не менее, важно отметить, что замораживание может PBMNCs снижают эффективность изоляции BOEC. SEE раздел 8 ниже способом. 4. Долгосрочное Культура клеток Изменение средней каждые 2 дня, добавив 15 мл свежей среды BOEC поколения (5: 1 смеси эндотелиальной среде для роста клеток и определили FBS). Для выходных, средние изменения может быть отложено на каждые 3 дня. ПРИМЕЧАНИЕ: вырост колонии должны появиться между 7 и 14 дней культуры. Монитор BOEC культуральной колбы на 7-14 дней для появления вырост колоний. Определить колонии в виде круговых групп клеток, проявляющих классический эндотелия булыжника морфологию. После того, как колонии или несколько колонии идентифицировали в колбе, продолжают со средними изменений и позволить расти колонии примерно 1000 до 2000 клеток на колонии, прежде чем пассирования. Определить количество клеток на колонию через грубой визуальной оценки. ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве руководства, это общепринято, чтобы прохода начальных колоний вырост одну неделю после идентификации первого вырост колонии. <Li> смешанные клетки путем промывки колбы дважды 10 мл DPBS. Добавляют 5 мл 1X трипсина-ЭДТА и инкубировать в 37 ° C инкубаторе в течение 5 мин. Через 5 мин, нейтрализуют трипсин с 10 мл среды (содержащей FBS) и довести клеток в суспензии с повторным пипетированием. Центрифуга суспензии при 300 мкг в течение 5 мин, ресуспендируют в 15 мл свежей среды BOEC поколения и пластины весь клеточной суспензии в новый Т-75 колбу (представляющего прохода 1, P1). Нет коллагена покрытие не требуется. Продолжить среднего изменения, как описано выше, пока клетки не сливающихся (примерно 3-5 × 10 6 клеток на колбу). После сли ни, клетки проход, как описано в шаге 4.3. ПРИМЕЧАНИЕ: Из прохода 2 года, клетки больше не требуется среду BOEC поколения и может культивироваться в эндотелиальных клеток ростовой среды и 10% стандартной инактивированной нагреванием FBS. Коллаген покрытие может быть использован в качестве необязательный шаг идти вперед, так как есть основания полагать, что наличие коллагена может повысить BOEC proliferAtion ставки. Для дальнейшего пассирования, плиты не менее чем 750000 клеток на Т-75 колбу, как плотность низкая клеток могут привести к BOECs, чтобы остановить пролиферирующих. 5. Замораживание и оттаивание BOEC Культуры Trypsinize клетки, как описано в разделе 4.3 и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют в 10 мл среды. Это не требует эндотелиальных клеток ростовой среды; DMEM с 10% FBS стандартных будет достаточно. Сбор 10 мкл образца суспензии клеток, чтобы выполнить вручную количества клеток с помощью гемоцитометра. Центрифуга снова ресуспендируют в и 2х10 6 клеток / мл в охлажденном льдом криоконсервации среды (40% DMEM с 50% FBS и 10% ДМСО). Добавить 0,5 мл (10 6 клеток) в каждом флаконе, место флаконы в ледяной холод изопропанол криоконсервации судна и места в -80 ° C морозильник по крайней мере 2 часа прежде, чем перейти к жидким азотом. Не оставить клетки при -80 ° С в течение более 24 часов. </lя> Для таять клетки, добавить 10 мл подогретого среды в 15 мл коническую центрифужную пробирку. ПРИМЕЧАНИЕ: При оттаивать Прохождение 1 клеток, оттепель в эндотелиальных клеток ростовой среды, дополненной 20% FBS, определенной в течение первых 2 дней после оттаивания. Это приводит к изоляции более стабильной клеточной идти вперед. Удалите клетки от жидкого азота и оттепели в 37 ° C бане воды с перемешиванием до тех пор, нежной лишь небольшое кристаллов льда осталось во флаконе. Добавить содержимое флакона по каплям к конической центрифужную пробирку и спин вниз в 300 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и осадок ресуспендируют клеток в 10 мл EGM-2 мВ + 10% FBS. Добавить в Т-75 колбу и пополнить среды до 15 мл. 6. Характеристика BOECs с помощью проточной цитометрии После того, как BOEC колонии, описанные в разделе 4 было разрешено расширить, Trypsinize клетки, как описано в разделе 4.4 и ресуспендируют при концентрации 10 6 клеток на мл в буфере окрашивания (DPBS остроумиеч 2% FBS и 2 мМ ЭДТА). Комбинат 10 5 клеток флуорохромом конъюгированного антител, направленных против CD45, CD14, CD34, CD31 (использовать все в 1:20 разбавления) или VEGFR2 (разбавить 1:10) (см таблицу 1 для получения подробной информации). Инкубировать в течение 30 мин при 4 ° С в темноте. Промыть клетки с 1 мл окрашивающего буфера и центрифуге при 300 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют в 400 мкл буфера для окрашивания для анализа. Сохранить клетки при 4 ° С в защищенном от света перед анализом. Выполнение цитометрии анализ на цитометр возможности для выявления флуоресцентно конъюгированных антител, используемых в анализе. Использование неокрашенной BOEC образец для идентификации клеточной популяции на цитометр, регулируя вперед и боковое рассеивание напряжений, а также напряжения для каналов FITC и APC. Определить стробирования пороги, используя изотипа окрашенных клеток для каждого флуорохромом. Оценка позитивности для каждого маркера клеточной поверхности на основе presencе пиковой сдвига в интенсивности флуоресценции по сравнению с контролем изотипа для флуорохромом анализируются. 7. Характеристика BOECs по иммунофлуоресцентных микроскопии Пластинчатые BOECs в 24-а, плоским дном планшета для культуры ткани без покровных при плотности 5 х 10 4 клеток в 500 мкл эндотелия среде роста клеток + 10% тепла инактивированной ФБС на лунку и оставить придерживаться и расти при 37 ° С, 5% СО 2 до клеток охватывать по крайней мере 70-80% площади поверхности каждой лунки (оценка слияния путем визуального осмотра под световым microsope). Вымойте клеток в каждой лунке в течение 5 мин с 1 мл DPBS. Исправление клетки O / N при 4 ° С с 500 мкл 4% -ного раствора параформальдегида в DPBS. Промыть клетки в течение 3 х 5 мин с 1 мл на лунку DPBS. Добавить и удалить DPBS помощью пипетки и аспиратор, соответственно. Проницаемыми клеток для 3 х 10 мин с 0,2% полисорбата 20 в DPBS. </li> Инкубируйте клетки в течение 1 часа при комнатной температуре в блокирующем буфере, содержащем 10% FBS в DPBS. Пятно клетки при 4 ° CO / N в 300 мкл буфера для разведения антител (0,1% бычьим сывороточным альбумином в DPBS), содержащей первичные антитела, направленные против CD34 (10 мкг / мл), CD144 (1: 300) или фактора Виллебранда (1: 250) , В таблице 1 для получения полной информации. Смыть несвязанных первичных антител в течение 5 х 10 мин с DPBS. Инкубируйте клетки в течение 1 часа при комнатной температуре с соответствующим флуоресцентно-меченного вторичного антитела, как указано в таблице 1 (все в 1: 200). Смыть несвязанных вторичных антител в течение 5 х 10 мин с DPBS. Инкубируйте клетки с 1 мкг / мл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в DPBS в течение 10 мин при комнатной температуре. Промыть клетки с DPBS в течение еще 3 мин х 5. Клетки изображение в 100-кратном увеличении, используя инвертированный микроскоп оснащен внешним источником света для возбуждения флуоресценции, и захват изображения с помощью приложитьред цифровая камера для последующего анализа в автономном режиме. 8. замораживание и оттаивание PBMNCs В конце стадии 3.2, После центрифугирования аспирата среды и вручную разрушить осадок клеток с повторным пипетированием вверх и вниз с помощью пипетки P1000 наконечник. Добавить 1 мл замораживания среды, 90% сыворотки и 10% ДМСО, убедившись, что аккуратно перемешать, чтобы произвести клеточной суспензии. Передача клеточной суспензии криопробирку и размораживать, как описано в разделе 5.

Representative Results

Выделение охристыми пальто мононуклеарных клеток из 60 мл крови, как правило, дает 100-150×10 6 Всего белых кровяных клеток. При покрытием в один Т-75 колбу, большое количество клеток в клеточной суспензии unlysed делает его трудно решить отдельные прилипшие клетки с помощью микроскопии светлого. Повторные средние изменения приводят в оформлении неадгезивных клеток и позволяют визуализации клейкой населения моноцитарно "ранних" ЕРС. На 7 день, Т-75 будет содержать примерно 7х10 6 из этих удлиненных адгезивных клеток. С 7 день до 14, колонии BOECs должен появиться в колбе (рис 2А). Колонии сначала появляются в 3 до 5 смежных клеток. Вырост номер колония может варьироваться от 1 до 10 колоний на 60 мл крови. Как правило, молодые доноры (т.е. 20-25 лет), как правило, для получения большего числа колоний выроста, которые также появляются в начале культуры.BOECs пролиферируют из этой центральной группы клеток образовывать колонии, состоящие круговые нескольких сотен клеток. Клетки в этих колониях демонстрируют классический эндотелия булыжника морфологию. Желательно, чтобы прохода исходных колоний, когда они содержат около 1000 клеток на колонии. Вырост колонии обычно достигают этого размера через 7 дней после их первоначального вида в культуре. После того, как первоначальные колонии пересаживали в новую Т-75 колбу, они должны распространяться, чтобы сформировать сливающийся монослой на (3-5×10 6 клеток на колбу) в течение 5 дней или меньше (Рис 2B). В небольшой процент выделений (<10%), вырост колонии не появляются, или не размножаются достаточно после этого первого шага пассирования. BOECs, которые обладают низкой пролиферации после первого пассирования редко идут дальше, чтобы стать стабильными BOEC изоляция и часто останавливаются пролиферирующих в течение двух-трех проходов. МоноцитарныхРанние ЕРС, содержащиеся в BOEC культур непролиферативная и, как правило, очищается от культур в течение 1-2 пассажей. Оформление этих ранних клеток-за гибели клеток, отказ начале клеток повторно придерживаться после пересева и разбавление не-пролиферативных начале ЕРС повторного пассирования с. Прохождение 1-клетки могут быть либо пассируют далее в культуре или замораживали для дальнейшего использования. После того, как выделение стабильно генерируется, клетки не могут быть пассировать в размере 1 сливной колбу на 3-5 новых Т-75 колбы вплоть до прохода 8 или 9, прежде чем стать покоя. Опять же, плотность клеток является критическим всей культуры. По нашему опыту, не менее чем 750000 клеток следует высевали в Т-75 колбу, как снижение плотности клеток может привести к аресту роста. Несмотря на высокую пролиферативный потенциал BOECs клетки также не следует допускать того, чтобы overconfluent (т.е..,> 5×10 6 клеток на колбу), так как это может привести к чаты ион BOECs к непролиферативной фенотипа. Мы полагаем, что любая клетка быть помечены как BOEC должен отображать соответствующую поверхность клеток и внутриклеточного окрашивания эндотелиальных маркеров. Характеристика BOECs может быть достигнуто с помощью проточной цитометрии (рис 3) или флуоресцентной микроскопии (рис 4), с последующим окрашиванием для типичных маркеров эндотелиальных клеток. BOECs положительны для CD31 эндотелиальные маркеры и поверхностные VEGFR2 и отрицательные для моноцитов CD14 маркера и пан-лейкоцитов маркера CD45. BOECs также принадлежать Вейбел-Паладе органы и таким образом выразить фактор Виллебранда (ФВ), как дискретной, точечной окрашивание цитоплазмы. В отличие от других развитых эндотелиальных типов клеток, таких как легочной артерии или аорты эндотелиальных клеток, BOECs также выразить прародителя и активации маркера CD34 на их поверхности. ftp_upload / 53384 / 53384fig1.jpg "/> Рисунок 1. Схема протокола BOEC поколения. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяют из венозной крови центрифугированием в градиенте плотности и культивировали на коллагеновых пластинок, покрытых в эндотелиальных среды роста, содержащей FBS определен. BOEC колонии появляются в течение 7-14 дней культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2. Светлое изображения представительных BOEC культур. (А) вырост колонии появляются в культурах между 7 дней и 14. колоний, присутствующих в коллекциях эндотелиальных клеток, как, которые расположены в булыжной монослоя и размножаются в радиальном направлении от центральной точки. Ближайшие вырост колонии приверженцем моноcytic клетки, которые составляют подавляющее большинство клеток в начале культур. Эти клетки, описанные ранее в "начале" эндотелиальных клеток-предшественников, имеют веретенообразную морфологию и выразить моноцитарных маркер CD14. (Б) После пассирования, высоко пролиферативные BOECs взять на культурах, как не-пролиферативных клеток моноцитов либо отмирают или не повторно прикрепить после пассирования. Масштабная линейка 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3. Характеристика BOECs с помощью проточной цитометрии. BOECs трипсинизировали и окрашивали флуоресцентно-сопряженных антител изотипа контроля (серый заполненный пик) или антител, направленных против конкретных поверхностных маркеров (красная линия). Поверхностные маркеры для цитометрического характеристикивключают гемопоэтические маркеры CD45 и CD14, эндотелиальные маркеры CD31 и VEGFR2 и progentior и эндотелиальной маркер CD34 активации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4. Иммунофлуоресцентное окрашивание BOECs эндотелиальных маркеров клеток. Представительства иммунофлуоресцентные изображения BOECs иммуноокрашиванию с антителами, направленными против поверхности клеток эндотелия маркера CD144 (VE-кадгерин, верхняя правая панель) и гликопротеин крови фактора фон Виллебранда (ФВ, нижняя правая панель) , Соответствующие панели, показывающие окрашивание DAPI ядерной показаны слева. Масштабная линейка 50 мкм. для CD144. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большеВерсия этой фигуры.

Discussion

We present a detailed protocol that allows for the robust and efficient derivation of BOECs from adult peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs). Our protocol includes two important refinements that represent advances on previous methods of BOEC isolation.^14-16 These include the absence of heparin in the initial PBMNC culture medium and the use of defined, embryonic stem cell-qualified serum. This latter refinement is of particular importance. Embryonic stem cell (ESC)-qualified serum is a more consistent grade of serum and, although it is not known yet what component(s) are enriched in the serum that benefit BOEC isolation, the impact of this defined serum on the efficiency of BOEC generation is clear in our hands. In addition, we have also had success in isolating BOECs using human serum, thereby allowing for the generation of BOECs for clinical translation. In our hands, this refined protocol results in the successful isolation of stable BOEC cultures from greater than 90% of donors, making it one of the most reliable BOEC generation methods reported thus far. Although the use of particular sera is critical to BOEC generation, it also represents a primary limitation of the current protocol. Future improvements to the technique could include the generation of these cells in serum-free, defined culture conditions.

Critical Steps in the protocol include processing blood samples as soon as possible after collection, complete harvesting of the buffy coat cells after density gradient centrifugation and the timely passaging of initial colonies from P0 to P1. This passaging step is critical to establishment of a stable isolation. Like other endothelial cells, BOECs appear to be very sensitive to plating density. If the plating density after passaging is too low, the BOECs will not proliferate. Conversely, if the colonies are allowed to become overconfluent before passaging, the cells will also cease to proliferate and have the tendency to convert into an elongated, mesenchymal cell phenotype. If few colonies appear from days 7 to 14, or if the colonies are small in size, troubleshooting can include increasing cell density by passaging P0 colonies into a T-25 flask instead of a T-75.

Once the technique is mastered, the resultant BOECs can be used in several applications, including in vitro studies of endothelial cell biology, disease modeling and drug screening, as well as in vivo cell transplantation therapies. An important consideration for the development of any cell therapy process is to use cells that are free from pathogenic mutations. We have previously shown that BOECs isolated using our protocol possess genomes that are free from copy number variations and are thus representative of the individual from which they were collected. In addition, we have also demonstrated that the majority of BOEC-derived iPSC lines are free from copy number variations.¹³ This contrasts with previous reports of copy number variation in fibroblast-derived iPSCs. To date, these cells remain the only iPSCs for which this degree of genomic fidelity has been reported. This feature is important for the field of iPSC biology and the use of iPSCs in disease modeling, drug screening and future cell transplantation therapies.

Materials

For blood collection
60 mL syringe with luer-lok tip	BD	309653
19G Surflo Winged Infusion Set	Terumo	SV-19BL
50 mL conical centrifuge tube	StarLab	E1450	2 per donor
Sodium Citrate	Martindale Pharmaceuticals	270541
Name	Company	Catalog Number	Comments
For buffy coat isolation
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+)	Sigma-Aldrich	D8537
Sterile wrapped plastic transfer pipettes	Appleton Woods	KC231
Turk’s Solution	Millipore	1.093E+09
Name	Company	Catalog Number	Comments
For cell culture, passaging and freezing cells
Type 1 Collagen (derived from rat tail)	BD Biosciences	35-4236
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+)	Sigma-Aldrich	D8537
0.02M Acetic Acid	Sigma-Aldrich	A6283	prepared in reagent grade water
Endothelial Growth Medium-2MV (containing Bullet Kit, but not serum)	Lonza	CC-3202	Note: It is essential that the medium does not contain heparin.   Do not use EGM-2.
Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined	Hyclone	SH30070
10x Trypsin EDTA	Gibco	T4174	Dilute to 1x in PBS prior to use
Heat Inactivated FBS	Gibco	10500-064
DMEM	Gibco	41965-039
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container	Sigma-Aldrich	C1562
Name	Company	Catalog Number	Comments
For flow cytometric characterization
FITC-conjugated mouse anti-human CD14	BD Biosciences	555397	Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD31	BD Biosciences	555445	Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human CD34	BD Biosciences	555824	Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34 Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD45	BD Biosciences	560976	Mouse IgG1k, Clone: HI30 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2	R&D Systems	FAB357A	Mouse IgG1, Clone: 89106 Dilution: 1:10
FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control	BD Biosciences	555748	Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control	BD Biosciences	555751	Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control	R&D Systems	IC002A Dilution: 1:10	Clone: 11711
EDTA, 0.5M solution	Sigma-Aldrich	E7889
Name	Company	Catalog Number	Comments
For immunofluorescent microscopy
Corning Costar 24-well tissue culture plate	Sigma-Aldrich	CLS3527
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Polysorbate 20	Sigma-Aldrich	P2287
Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody	R&D Systems	MAB72271	Clone 756510, IgG1, use at 10 μg/ml
Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144)	R&D Systems	AF938	Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300
Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF)	Abcam	ab154193	Clone EPSISR15, use at 1:250
Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-21202	Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200
Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11055	Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate	Life Technologies	A-10042	Polyclonal,  2 mg/ml, 1:200
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542	use at 1 μg/ml