Meten van fysiologische reacties<em> Drosophila</em> Sensorische neuronen te Lipid Feromonen met Live Calcium Imaging
Summary
The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.
Abstract
In tegenstelling tot zoogdieren, insecten zoals Drosophila hebben meerdere smaak organen. De chemosensory neuronen op de benen, slurf, vleugels en ovipositor van Drosophila uiten smaak receptoren 1,2, ionkanalen 3-6 en ionotrope receptoren 7 die betrokken zijn bij het opsporen van vluchtige en niet-vluchtige zintuiglijke signalen. Deze neuronen direct contact tastants zoals voedsel, schadelijke stoffen en feromonen en daardoor ook op vele complexe gedrag, zoals voeding, eieren leggen en paring. Elektrode opnames en calcium imaging zijn op grote schaal gebruikt bij insecten aan de neuronale reacties opgeroepen door deze tastants kwantificeren. Echter, elektrofysiologie vereist gespecialiseerde apparatuur en het uitvoeren van metingen van een enkele smaak sensillum kan technisch uitdagend zijn, afhankelijk van de cel-type, de grootte en positie. Bovendien kan enkel neuron resolutie in Drosophila moeilijk te bereiken, aangezien smaak sensilla house meer dan één type chemosensory neuron. De live calcium imaging hier beschreven methode maakt reacties van enkele smaak neuronen in levende vliegen te meten. Deze methode is vooral geschikt voor het afbeelden van neuronale reacties op lipide feromonen en andere ligand soorten die lage oplosbaarheid in water gebaseerde oplosmiddelen.
Introduction
Dieren vertrouwen op geur en smaak informatie om beslissingen essentieel voor de overleving en voortplanting bemiddelen. Begrijpen hoe chemosensory signalen worden gedetecteerd en verwerkt door het zenuwstelsel vereist identificatie van de sensorische receptor (en) en de overeenkomstige chemische liganden. Drosophila detecteren van een groot aantal vluchtige en niet-vluchtige verbindingen en zijn een uitstekend model waarin de fysiologische bestuderen mechanismen die ten grondslag liggen aan chemosensation. Terwijl de reukorganen waarnemen vluchtige moleculen, worden de smaak organen gespecialiseerd in het lage volatiliteit verbindingen te detecteren. Hier presenteren we een methode om neuronale antwoorden van de smaak organen van Drosophila melanogaster met lage vluchtigheid, lipofiele liganden direct te meten.
Smaak organen van de vlieg onder de voorpoten, slurf, en vleugels. Verspreid over het oppervlak van de smaak organen hair-achtige structuren bekend als sensilla die reageren op sugars, bitters, zouten, water en feromonen 8. De sensilla zijn morfologisch ingedeeld in smaak haren en smaak haringen 9. Er zijn ongeveer 31 smaak haren op de lip die zijn ingedeeld in de lange (l-type), korte (s-type) en tussenproduct (i-type) morfologie. De 'l' en 's' sensilla huis 4 sensorische neuronen die fysiologisch reageren op suiker (de S cel), zoutarm (de L1 cel), hoge zout en bitter verbindingen (de L2 cel) en water (de W-cel) 10 , 11. De 'i' sensilla huis 2 sensorische neuronen, waarvan er één reageert zowel laag zout en suiker, terwijl de andere reageert op een hoog zoutgehalte 12. Er zijn ongeveer 41 smaak sensilla bij mannen en 26 vrouwen in sensilla verdeeld zijn over de van de voorpoten. Voor zowel mannen als vrouwen, zijn er 21 sensilla de midleg, en ongeveer 22 sensilla het achterbeen 13. De smaak neuronen ingesloten door de smaak sensilla op de poten zijn ook classified in L1, L2, W en S vormen.
Een standaardwerkwijze voor het meten van elektrische activiteit van enkelvoudige neuronen gebruikt extracellulaire of intracellulaire elektroden ionenstroom nemen. Elektrode metingen laten neuronale functie in niet-model organismen te bestuderen zoals Drosophila species, motten, en de bijen die een uitgebreide genetische instrumenten voor neurale etikettering ontbreken. Echter, terwijl de elektrofysiologische methoden routinematig gebruikt om de activiteit meet van Drosophila smaak sensilla 4,13,14, de toepassing van deze aanpak biedt een aantal technische uitdagingen. Ten eerste, de smaak haren moeten worden geïdentificeerd op basis van de morfologie en de ruimtelijke locatie. Na identificatie, kan elektrofysiologische metingen worden belemmerd door de kleine omvang van de sensilla beperkt toegankelijk door het positie en moeilijkheden bij de toepassing van gecontroleerde hoeveelheden van een chemische stimulus om een smaak haren. Ook kunnen stimuleren sensilla signalen van meerdere genererenneuronale soort 15. Ten tweede kan de detectie van elektrische signalen worden verstoord door achtergrondgeluiden als gevolg van mechanische trillingen en het lawaai van elektronische apparatuur. Ten derde kan het gebruik van een scherp elektrode beschadigen vlieg preparaat, bij abnormaal 14 gebruikt. Tot slot, het samenstellen van een elektrofysiologie rig vereist gespecialiseerde elektronische componenten voor stimulus levering, signaal opname en data-analyse en kan kostbaar zijn.
In D. melanogaster, de beschikbaarheid van genetisch gecodeerde instrumenten heeft de ontwikkeling van beeldvormende technieken waarmee de reacties van kleine populaties van neuronen te bestuderen. Eén dergelijke benadering is het gebruik van de CaLexA reporter 16. In deze werkwijze worden gensequenties die coderen voor de LexA-VP16 transcriptiefactor en een calcium- gevoelig eiwit NFAT samengesmolten. Calcium activatie van het proteïne fosfatase calcineurine katalyseert het de fosforylering van NFAT en, op zijn beurt, FacilitaTES de invoer in de kern. In de kern, de LexA domein bindt aan een LexAOp-DNA-bindend motief dat de expressie van groen fluorescent eiwit (GFP) reporter verbindt, waardoor aanhoudende identificeren functioneel geactiveerde neuronen. De aanpak is met succes gebruikt om de reactie van specifieke olfactorische glomeruli in de antennaal kwab na blootstelling van levende vliegen een geurstof 16 meten. Onlangs, fysiologische reacties van IR52c smaak receptor neuronen werden gemeten tijdens live-vliegen met behulp van CaLexA 7. Voor deze studie was het noodzakelijk leeftijd vliegen tot 6 weken GFP transcriptie verhoogt. Terwijl immunokleuring met een anti-GFP antilichaam kan worden gebruikt om het signaal te versterken CaLexA zou deze methode fixatie van het weefsel vereisen, waardoor elke mogelijkheid van live cell imaging.
De genetisch gecodeerde eiwit calciumindicator GCaMP is ook uitgebreid gebruikt om neuronale respons studie in een aantal17 species. Het eiwit GCaMP fluoresceert met een lage intensiteit voorafgaand aan neuronale stimulatie. Toepassing van een stimulus veroorzaakt een actiepotentiaal in het neuron, waardoor de influx van Ca2 +. GCaMP, gebonden aan Ca2 +, ondergaat een conformationele verandering waardoor het fluoresceren met heldere intensiteit (Figuur 1). Een recent ontwikkelde één neuron calcium imaging aanpak werd toegepast om glucose identificeren als de ligand voor de voorpoot specifieke Gr61a smaak neuronen 18. In deze studie werden ontleed voorbenen uit transgene Drosophila expressie GCaMP in Gr61a smaak neuronen bedekt met een laag agarose vóór beeldvorming. Echter, kan het gebruik van ontleed weefsel uiteindelijke overzicht van GCaMP uitdrukking veroorzaken, waardoor het beperken van meettijd en detectie gevoeligheid. Bovendien kan agarose gevoeligheid tengevolge van de hoge achtergrondniveaus van fluorescentie en lichtverstrooiing eigenschappen.
To richten sommige van deze nadelen beschrijven we het gebruik van GCaMP gemedieerde calcium imaging fysiologische reacties van voorpoot en slurf smaak neuronen van intacte dieren nemen. We tonen de fysiologische reacties van Gr68a en ppk23 neuronen tot expressie genetisch gecodeerde GCaMP5G 19 een Drosophila lipide feromoon, (3R, 11 Z 19 Z) -3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. Neuronale responsen worden gemeten door het kwantificeren van de toename in fluorescentie van het signaal gedurende GCaMP5G feromoon stimulatie. In dit protocol wordt neuronen afgebeeld voor een totale duur van 120 seconden, wat voldoende is om patronen van neuronale activatie in individuele cellen differentiëren.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven hier een werkwijze live calcium beeldvorming van Drosophila perifere neuronen uitvoeren 2 verschillende zintuigen. De Ca 2+ -evoked GCaMP fluorescerende reacties in Gr68a-neuronen geïnduceerd door het feromoon ligand CH503 waren dosis-afhankelijk en kwantitatief. Het was ook mogelijk om verschillende neurale respons patronen zoals fasische en tonische reacties onderscheiden.
Neuronen toont fasische respons wordt aangenomen dat een snelle aanpassing laten c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).
Materials
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287, 1830-1834 (2000).
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell Rep. 1, 599-607 (2012).
- Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity. PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors. Neuron. 83, 850-865 (2014).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).
- Rodrigues, V., Siddiqi, O. A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors. Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J. Vis. Exp. , e51355 (2014).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).
- Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor. J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).
- Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons. PloS One. 8, e56304 (2013).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Shikichi, Y., et al. Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers. Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).
- Yew, J. Y., et al. A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila. Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).
- Bray, S., Amrein, H. A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship. Neuron. 39, 1019-1029 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance. Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).
- Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems. Front Neurosci. 4, 53 (2010).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Busch, K. E., et al. Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state. Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).
