Otimização do Ensaio Wound zero para detectar mudanças na Murino estromais mesenquimais migração celular após a lesão por Extract fumo do cigarro Solúvel
Summary
The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.
Abstract
Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.
Introduction
A migração celular é altamente coordenada e vital para muitos processos fisiológicos, tais como desenvolvimento do tecido, reparação e regeneração, bem como processos patológicos tais como a metástase do cancro e arteriosclerose 1. Uma compreensão da migração celular é particularmente relevante para as terapias emergentes utilizadas para reparar tecidos danificados e tratar condições patológicas, incluindo as tecnologias de transplante de células e tecidos artificial enxerto 2. Dado o interesse atual no papel de células estromais mesenquimais (MSCs) na mediação de reparação de tecidos 3, quantificando a capacidade migratória destas células usando um ensaio que é rigorosamente quantificável, adaptável e relação custo-benefício é de interesse. É importante ressaltar que tal ensaio deve ser suficientemente sensível para detectar mudanças relativamente sutis na capacidade migratória celular após dano. Os métodos actuais para quantificar a migração de células, incluindo ensaios de risco, os ensaios de migração trans-poços (CH Boydenâmbares), matrizes micropillar e ensaios zona de exclusão de células possuem uma série de limitações na reprodutibilidade, personalização, quantificação e custo-efetividade 1,4,5. O ensaio zero otimizado aqui descrito demonstra resultados robustos, capacidade de análise quantificáveis e baseados em imagem, relação custo-eficácia e capacidade de adaptação a outras aplicações.
Os ensaios de raspadinhas têm sido utilizados em várias capacidades para avaliar a migração celular e proliferação em diferentes condições experimentais 5. O ensaio implica semeando as células designadas, cultivá-las para completar ou próximo da confluência, e coçar a monocamada resultante com uma agulha estéril ou ponta de pipeta 6. Análise é mais vulgarmente efectuada por comparação da largura do zero ao longo de múltiplos pontos de tempo em locais seleccionados aleatoriamente 7-9. Apesar de seu uso proeminente, o ensaio do zero é confundida por problemas com a reprodutibilidade e quantificação. A variabilidade nageração de zero a não apenas altera o microambiente das células, mas também pode impedir a migração de células ao danificar a superfície da placa e da matriz extracelular subjacente 5. Os ensaios são frequentemente realizados ao longo de 7 a 12 h, no entanto, para linhas de células exibindo migração mais lenta e os tempos de ensaio mais longos, a proliferação torna-se uma variável de confusão 7,10. Por último, as células senescentes gerados pelo processo de coçar pode libertar factores que interferem com a sinalização extracelular necessária para fechar a fenda na monocamada 1. Optimizar a zero ensaio requer a criação de uma diferença consistente, que não interfere com as propriedades de superfície, minimizando o comprimento de tempo de ensaio, e a prevenção da morte de células indesejáveis durante a manipulação. O ensaio à base de batente consiste numa optimização do ensaio de uma zona de exclusão de células. Este ensaio utiliza uma rolha colocado no meio do poço que exclui o crescimento celular, mas permite que as células a ser revestida em volta da zona de exclusão central.Para avaliar a migração, a tampa é removida, e a zona de exclusão resultante proporciona uma superfície para a migração ocorra. No entanto, este ensaio é difícil para personalizar ou adaptar a 10 e para algumas aplicações, esta técnica também pode ser um custo proibitivo.
Em contraste com os ensaios de zero e os seus derivados, ensaios de trans-migração bem (ou ensaios de câmara de Boyden) avaliar a migração através da quantificação do número de células que se movem de uma câmara, através de um filtro de membrana microporosa, para uma câmara contendo agentes quimiotácticos 8,11, 12. Esta técnica tem utilidade limitada para as células aderentes como as MSCs porque após a migração através da membrana porosa, as células aderem ao lado da membrana exposta aos agentes quimiotácticos, e pode ser difícil de quantificar com precisão. Enquanto o ensaio é capaz de analisar alguns padrões de migração tridimensionais, os tipos de células restritas para o qual é capaz de quantificar com precisão limite de migração celular sua utilidade 10. Outra alternativa para ensaios de zero usa uma rede de micro-pilar, que mede a motilidade celular através de um espaço tridimensional utilizando a capacidade das células para se deformar e migram para a matriz como um substituto. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastómeros curados sobre um molde preciso e tratada com ozono e fibronectina produz um microambiente homogénea e não degradável. Espaçamento Micro-pilar também pode ser variado conforme necessário para avaliar a capacidade das células para introduzir a matriz 4. O molde é criado por meio de gravura de ião reactivo profundo de bolachas de silício para criar uma versão da matriz negativa de alta relação de aspecto 13. Enquanto o ensaio é reforçada pela sua capacidade de personalização, capacidade de modelar a migração tridimensional, e análise através da visualização direta de células que migram, dificuldade em criar micro-pilar matrizes impede economicamente seu uso generalizado.
O ensaio zero otimizado descrito neste protocolo oferece uma eficiente, cosmétodo t-eficaz para produzir arranhões consistentes que podem ser analisados usando o software disponível gratuitamente. Em vez de medidas de largura simples, feitas em toda a zero antes e depois da migração celular, o software permite ao usuário determinar áreas totais scratch antes e depois da migração. Este avanço limita a questão de tentar determinar onde a zero as medidas de largura devem ser tomadas, e se a largura do zero é uniforme ao longo dela de comprimento. Além disso, a optimização cuidadosa dos números de células, confluência celular e o tipo e grau do dano infligido nas células é discutida, a fim de optimizar ainda mais o ensaio.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui fornece um método quantitativo robusto, padronizado para executar e analisar testes de zero. Ensaios simples arranhão são rotineiramente utilizados em muitas áreas diferentes de estudo para analisar a migração celular. No entanto, tradicionalmente o ensaio zero faltou um set-up e quantificação protocolo padronizado, o que levou a problemas com a reprodutibilidade 7,10. Muitas das modificações e otimizações para melhorar o ensaio zero reduziram essas questões, incluindo i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.
Materials
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healting plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
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