A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.
نظام كولاي القولونية التعبير هو أداة قوية لإنتاج بروتينات حقيقية النواة المؤتلف. نستخدمها لإنتاج Shadoo، وهو بروتين عائلة بريون. وأعرب طريقة الكروماتوغرافي لتنقية (صاحب) 6 -tagged Shadoo المؤتلف كما هو وصفها الهيئات إدراج. وsolubilized الهيئات إدراجها في 8 M اليوريا وملزمة لني 2+ العمود -charged لأداء أيون التقارب اللوني. ومزال البروتينات ملزمة متدرجة من إميدازول. يتعرض الكسور التي تحتوي على البروتين Shadoo إلى استبعاد حجم اللوني للحصول على بروتين عالي النقاء. في خطوة تنقية النهائي Shadoo والمحلاة لإزالة الأملاح واليوريا وإميدازول. البروتين Shadoo المؤتلف هو كاشف المهم للدراسات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية من اضطرابات التشكل البروتين التي تحدث في أمراض البريون. أظهرت العديد من التقارير أن الأمراض العصبية بريون تنشأ من ترسب طعنةلو أمرت الألياف اميلويد. / ترد بالوسط الأساسية عينة البروتوكولات التي تصف كيفية fibrillate Shadoo إلى الألياف اميلويد في الحمضية ومحايدة. الطرق حول كيفية إنتاج وfibrillate Shadoo يمكن أن تسهل البحوث في المختبرات العاملة في مجال الأمراض بريون، لأنه يسمح لإنتاج كميات كبيرة من البروتين بطريقة سريعة ومنخفضة التكلفة.
أمراض الاعصاب بريون، التي تشمل البقري مرض جنون البقر في، سكرابي في الأغنام ومرض كروتزفيلد جاكوب في البشر، هي قاتلة وغير قابل للشفاء. تتميز أمراض البريون من قبل التغييرات متعلق بتكوين من بروتين بريون الخلوي تتكون أساسا من α-اللوالب، إلى منطقة β ورقة عبر التخصيب اميلويد الملتزم 1،2. عبر β-هياكل تحتوي على المكتظ وأمر غاية β اوراق مثل البلورية استقرت مع الروابط الهيدروجينية 3،4. amyloids بريون يمكن نسخ الذاتي المناسب إلى خيوط β على حافة المتزايدة التي توفر نموذجا لتوظيف وتحويل وحدة البروتين أحادى.
وفقا لفرضية "البروتين فقط"، والملتزم اميلويد من بروتين بريون هي الوكيل الوحيد المعدية. ومع ذلك، فقد تم اقتراح بعض الجزيئات الحيوية الأخرى على أنها ضرورية لاضطرابات بريون. على سبيل المثال، يعتقد أن أغشية الخلايا لتكون مكانا حيث conversiعلى سيقام وقد أظهرت بعض الدهون سالبة الشحنة لتعزيز 5،6 عملية التحويل. وبالإضافة إلى ذلك، قد تكون بعض البروتينات أيضا تشارك في أمراض البريون. على وجه التحديد، هناك اثنين آخرين من أعضاء الأسر من البروتين بريون: Doppel وShadoo 7،8. Doppel لديها بنية جامدة نسبيا استقر مع الجسور دى كبريتيد وفشل لبلمرة الذات ومجموع المباراتين لييفات اميلويد 9. في المقابل، على غرار بروتين بريون، يمكن Shadoo اعتماد هيكل المخصب ورقة β-والزميلة الذاتي في الهياكل ييف اميلويد. تبين أن Shadoo يمكن fibrillate في ظل ظروف الأم أو على الأغشية ملزمة سالبة الشحنة 10،11. تحويل Shadoo إلى ألياف تشبه اميلويد قد تترافق مع أمراض. في الواقع، وغير مفهومة الآليات التي هياكل تشبه اميلويد تسبب المرض.
Shadoo يتحمل مجال مسعور (HD)، وسلسلة من جنبا إلى جنب الارجنتين / الغليسين يكرر ر مماثلس الجزء N-محطة للبروتين بريون (الشكل 1A). كما-N محطة جزء من بروتين بريون، وغاية اتهم Shadoo بشكل إيجابي ويبدو أن غير منظم أصلا البروتين 11،12. يبدو Shadoo أن تكون ذات صلة وظيفيا إلى اضطرابات بريون أنه يمكن ربط مباشرة بروتين بريون. بالإضافة إلى ذلك، ينظم التعبير إلى أسفل أثناء بريون أمراض 13،14. ومع ذلك، لم يثبت حتى الآن دور Shadoo في مرض بريون.
وضعنا البلازميد التي تحمل تسلسل ترميز الجين الماوس Shadoo. تم استخدام البلازميد لتحويل E. القولونية لإنتاج N-صاحب محطة 6 الانصهار البروتين Shadoo. تم تأسيس هذا النظام التعبير بشكل جيد في مختبرنا ويستخدم عادة في مشاريعنا الجارية 6،15،16. قضية مهمة للتعبير عن Shadoo هو اختيار E. سلالة القولونية. بينما يستخدم BL21 المختصة سلالة بكتيرية عادة للتعبير عن المؤيد المؤتلفوأعرب عن البروتينات Shadoo بنجاح وتنقيته فقط من سلالة بكتيرية تحول SoluBL21. SoluBL21 E. المختصة القولونية هي متحولة تحسين BL21 سلالة المضيف المتقدمة لإنتاج البروتينات التي التعبير في BL21 الأم أعطى أي منتج قابل للذوبان يمكن كشفها. التعبير عن مستوى عال من Shadoo في SoluBL21 E. القولونية يؤدي إلى تراكم البروتين في الهيئات إدراج. كسمة عامة، عندما يتم التعبير عن درجة عالية من بروتين غير الناطقين بها في E. القولونية، هذا البروتين يميل إلى تتراكم في الهيئات إدراج غير قابلة للذوبان. Shadoo ربما المجاميع من خلال التفاعلات غير التساهمية مسعور أو الأيونية (أو مزيج من الاثنين معا) إلى البنى الدينامية التخصيب التي شكلتها البروتين مطوية بدرجات متفاوتة. ونتيجة لذلك، تتكون تنقية اثنين على الأقل من الخطوات التالية: (أ) فصل انتقائي من البروتين من الجزيئات الحيوية الأخرى في وسط تمسخ، و (ثانيا) من استعادة الطبيعة من البروتين النقي يستخدم في المختبر للطيالتقنيات.
وقد تحقق الفصل الانتقائي للShadoo في حل العازلة التي تحتوي على اليوريا 8M (أو بدلا من ذلك 6M الجوانيدين حمض الهيدروكلوريك). ويمكن أن يتم إزالة اليوريا واستعادة الطبيعة من البروتين عن طريق تطبيق بروتوكولات مختلفة: (ط) استعادة الطبيعة في محلول درجة الحموضة الحمضية للحصول على غير منظم البروتين Shadoo أحادى، أو (ب) استعادة الطبيعة في حل من الرقم الهيدروجيني ≥ 7 للحصول على Shadoo بلمرة إلى ألياف الأميلويد مستقرة بزخارف عبر β ورقة مميزة.
ويرد بروتوكول سهلة وفعالة لكلا التعبير وتنقية كمية كبيرة من الماوس المؤتلف البروتين Shadoo. الطريقة الموصوفة يسمح ذوبان ناجحة وتنقية (صاحب 6) -tagged البروتين Shadoo المؤتلف. من المهم، كما ورد في العنوان، وأنه عندما أعرب في بكتيريا E. بدائيات النواة القولونية Sha…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge Natalie Doude and David Westerway (University of Alberta) for providing us Sho cDNA, Christophe Chevalier (INRA) for plasmid construction, Michel Brémont (INRA) for providing us BL21Sol bacteria; Christine Longin (INRA) for TEM assistance and Edith Pajot-Augy (INRA) for comments and proofreading.
AKTA FPLC | GE, Amersham | # 1363 | |
HiLoad 16/60 Superdex | GE Healthcare | 17-1069-01 | |
HiTrap IMAC | GE Healthcare | GE17-0920-05 | |
HiPrep26/10 Desalting column | GE Healthcare | GE17-5087-01 | |
SoluBL21 Competent E. coli | Genlantis | C700200 | |
pET-28b+ | Novogen | 69865-3 | |
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
LB-Broth medium | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Eppendorf Biophotometar | Eppendorf | 550507804 | |
Trito X-100 | Life Technologies | 85111 | |
NiSO4 | Sigma-Aldrich | 656895 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T | |
Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693116001 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Imidazol | Sigma-Aldrich | I5513 | |
Gdn-HCl | Sigma-Aldrich | G4505 | |
protein size marker | Thermo Fisher Scientific | 26620 |