Una strategia per convalidare il ruolo di callose mediata Plasmodesmal gating nella risposta Tropic

Summary

Questo articolo descrive i metodi per lo screening dei geni che controllano la permeabilità plasmodesmal e pendenza, quindi, auxina durante la risposta tropico. Ciò comprende la misurazione del grado di risposta tropico in hypocotyl di Arabidopsis thaliana e controllando la permeabilità plasmodesmal da acido 8-idrossipirene-1,3,6-trisolfonico (HPTS) carico e valutazione del livello di fine callose.

Abstract

L'ormone vegetale auxina gioca un ruolo importante in molti processi di crescita e sviluppo, comprese le risposte tropico alla luce e gravità. La creazione di un gradiente di auxina è un evento chiave che porta a fototropismo e gravitropismo. In precedenza, polare trasporto auxina (PAT) è stato mostrato per stabilire un gradiente di auxina in domini diversi cellulari delle piante. Tuttavia, Han et al. Recentemente dimostrato che per la corretta formazione dell'auxina pendenza, plasmodesmal connettività symplasmic callose mediata tra le celle adiacenti è anche un fattore critico. In questo manoscritto, la strategia per chiarire il ruolo di particolari geni, che possono influenzare fototropismo e gravitropismo alterando la connettività symplasmic attraverso la modulazione sintesi callose plasmodesmal, è discusso. Il primo passo è quello di vagliare le risposte tropicali aberranti da 3 giorni di età piantine eziolati di mutanti o sovra-espressione righe di un gene con il tipo selvatico. Questo screening preliminarepuò portare alla individuazione di una serie di geni che funzionano in PAT o di controllo della connettività symplasmic. La seconda proiezione prevede l'ordinamento dei candidati che mostrano risposte tropicali alterato da influenzare la connettività symplasmic. Per affrontare tali candidati, il movimento di un tracciante symplasmic e la deposizione di callose plasmodesmal stati esaminati. Questa strategia potrebbe essere utile per esplorare nuovi geni candidati che possono regolare la connettività symplasmic direttamente o indirettamente durante risposte tropicali e altri processi di sviluppo.

Introduction

Le piante, come gli organismi viventi sessili, hanno sviluppato una rete altamente sofisticata di cella-a-cella di segnalazione per affrontare i vari stimoli ambientali. risposte Tropic sono uno dei fenomeni con cui le piante rispondono agli stimoli ambientali. Le piante mostrano due principali risposte tropico, fototropismo e gravitropismo. piante fotosintetiche si piegano verso la fonte di luce da fototropismo per raccogliere il massimo di energia. Analogamente, gravitropismo rende le piante a crescere verso il centro di gravità. Il meccanismo fondamentale che porta a tali risposte tropicali comporta la formazione di pendenza asimmetrica del phytohormone auxina ^1. L'atto di formazione dell'auxina gradiente locale è ben caratterizzata; i geni che sono coinvolti in questo meccanismo di fornire una tabella di marcia per l'azione ormonale ^2-8. La posizione specifica dei vettori auxina di efflusso, come ad esempio il PIN-formate (PIN) e P-glicoproteine, esegue il movimento di auxina dal citoplasma alla parete cellulare delle cellule del donatore ^9,10. Fnoltre, dalla H ⁺ / IAA attività symport attiva dei vettori afflusso auxina, come le proteine ​​della famiglia LAX AUX1 /, auxina viene finalmente consegnato alle cellule adiacenti ricevitore ^2,11,12. Questo movimento direzionale di auxina è noto come trasporto auxina polare (PAT). PAT porta ad una distribuzione differenziale auxina durante le varie fasi di sviluppo e in risposta a differenti stimoli ambientali ^13,14. Inoltre, l'interruzione nella localizzazione o l'espressione di uno qualsiasi di questi vettori afflusso o di efflusso auxina porta a gravi alterazioni nel PAT, che causa una perturbazione del gradiente auxina, portando a difetti di sviluppo. Recentemente, Han et al. ha riferito che la regolamentazione plasmodesmal è anche necessario per mantenere il gradiente auxina ^15. Ad oggi, più di 30 proteine ​​plasmodesmal sono state identificate ^16. Tra queste proteine, AtGSL8 'stato segnalato come un enzima chiave per la sintesi callose a plasmodesmi (PD) e, quindi, svolge un ruolo fondamentale nel maintaining il limite PD dimensione di esclusione (SEL). Espressione AtGSL8 repressa ha determinato un modello di auxina gradiente distorto che porta a nessuna risposta tropico in contrasto con piantine di tipo selvatico ^15.

In questo manoscritto, i metodi di esplorare nuovi geni candidati che sono coinvolti nella regolazione PD sono forniti. AtGSL8 stato usato come una proteina modello per testare questi metodi, in quanto è un enzima chiave contribuendo a PD biosintesi callose. A causa della piantina-letalità di gsl8 knock-out mutanti ^17, desametasone (dex) -inducible linee RNAi sono stati utilizzati secondo un rapporto pubblicato in precedenza ^15. La strategia qui fornite può essere adattato a screening geni che sono implicati in risposta hypocotyl tropico controllata da PD SEL.

Protocol

1. Lo screening dei mutanti con Altered fototropico e gravitropica Risposte Preparare 1x Murashige e Skoog (MS) Medium, pH 5.7, con il 0,8% Agar Un giorno prima dell'esperimento. Aggiungere 800 ml di acqua bidistillata in una beuta da 2 L e mescolare con una barra magnetica. Aggiungere 4,4 g di sale MS al pallone conico. Aggiungere 0,5 g di 2- (N-morfolino) etano solfonico (MES) e agitare fino a quando tutti i sali sono completamente disciolti. Regolare il pH del mez…

Representative Results

Nella configurazione attuale, desametasone (dex) -inducible linee RNAi di AtGSL8 [d'ora in poi dsGSL8 (+ dex / -dex)] sono stati utilizzati, come omozigote gsl8 mutanti di inserzione T-DNA sono piantina letale 18. Tre giorni di età piantine eziolati di dsGSL8 e piantine wild type con Dex ± sono stati esposti a stimoli fototropiche e gravitropica. Abbiamo scoperto che dsGSL8 (+ DEX) piantine erano difettose in fototropismo e gr…

Discussion

In questo manoscritto, una strategia per lo screening linee mutanti / sovra-espressione che sono difettosi nelle risposte fototropiche e gravitropica a causa di alterata callose PD e, di conseguenza, PD SEL è descritto in dettaglio. sintesi callose PD e la degradazione avviene principalmente da sintasi callose e β-1,3-glucanasi, ma regolazione di questi enzimi è controllata da molti fattori a monte. Per verificare tali fattori a monte o candidati che sono direttamente coinvolti nella regolazione del PD, abbiamo creat…

Materials

HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)	Sigma	H1529-1G	Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Used for HPTS agarose block
Microwave oven	LG-Goldstar		Machine for boiling agarose gel
100 mL glass conical flask	Dong Kwang	A0205	Used to boil HPTS agarose gel
Petri Dish (35×10 mm)	SPL life sciences	SPL10035	Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples
Microscope cover slides and glass slides (24 x 50 mm)	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 x 125 x 20 mm	SPL life sciences	SPL11125	Plates to make MS agar medium
Scissors	Germany Stainless	HSB 942-11	Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Duchefa	P10453.01	MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Bioshop	3G30212	To make MS media.
Plant agar	Duchefa	P1001.1000	To solidify MS media.
Autoclave	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips	Sorenson	10040
1 ml pipette	BioPette	L-1101-2
Surgical tape	MIcropore	1530-0	To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue)	Sigma	M5528-25G	Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine	Bioshop	GLN001	Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG	Sigma	D8375-1G	Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope	Olympus	FV1000MPE SIM	To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer	I lab	K400	To mix media solution.
Aluminium foil	SW cooking foil		To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite	Samjin Industry		To surface-sterilized seeds