Un Test PCR duplex digitale per simultanea quantificazione del<em> Enterococcus spp.</em> E l'umano fecale associata HF183 Marker in Waters
Summary
Questo manoscritto descrive un saggio PCR duplex digitale che può essere utilizzato per quantificare contemporaneamente Enterococcus spp. E marcatori genetici HF183 come indicatori di contaminazione fecale generale e umana associati nelle acque ricreative.
Abstract
Questo manoscritto descrive una PCR digitale duplex (EntHF183 dPCR) per la quantificazione simultanea di Enterococcus spp. E il marcatore HF183 fecale-associata umana. Il EntHF183 duplex dPCR (denominato come EntHF183 dPCR esso contenute) saggio utilizza gli stessi primer e sonda sequenze come le sue singole controparti pubblicati PCR quantitativa (qPCR). Allo stesso modo, le stesse procedure di filtrazione dell'acqua e di estrazione del DNA come eseguita prima di qPCR sono seguiti prima di eseguire dPCR. Tuttavia, il test dPCR duplex ha diversi vantaggi rispetto ai saggi qPCR. Più importante, il dosaggio dPCR elimina la necessità per l'esecuzione di una curva standard e, quindi, la distorsione e variabilità associata, dalla quantificazione diretta dei suoi obiettivi. Inoltre, mentre la stampa duplex (ovvero la quantificazione simultanea) Enterococcus e HF183 in qPCR spesso porta a grave sottovalutazione del target meno abbondanti in un campione, dPCR fornisce la quantificazione coerente di entrambi gli obiettivi, stuzzicarela quantificato singolarmente o contemporaneamente nella stessa reazione. Il dosaggio dPCR è anche in grado di tollerare concentrazioni di inibitori di PCR che sono uno o due ordini di grandezza superiori a quelle tollerate dal qPCR. Questi vantaggi rendono il saggio EntHF183 dPCR particolarmente interessante perché fornisce contemporaneamente informazioni precise e ripetibili sia contaminazione fecale generale e umana associati nelle acque ambientali senza la necessità di eseguire due saggi qPCR separati. Nonostante i suoi vantaggi rispetto qPCR, il limite superiore quantificazione del test dPCR con strumentazione attualmente disponibile è di circa quattro ordini di grandezza inferiore a quella ottenibile con qPCR. Di conseguenza, la diluizione è necessaria per la misura di concentrazioni elevate di organismi bersaglio come quelli tipicamente osservati dopo fuoriuscite di liquami.
Introduction
Metodi quantitativi PCR (qPCR) sono stati ampiamente utilizzati per il monitoraggio della qualità delle acque di ricreazione e microbiche applicazioni di tracciamento fonte perché sono più veloci, più flessibili e specifiche rispetto ai metodi di coltura a base di tradizionali. Di conseguenza, qPCR è consigliato per il raggiungimento di risultati di monitoraggio delle acque rapidi per gli indicatori fecali generali come Enterococcus spp. Nelle riviste USEPA ACQUATICI criteri di qualità 1. Molti saggi qPCR sono stati sviluppati e validati per identificare le fonti di contaminazione fecale nelle acque ambientali 2. Tra questi, i saggi marcatori HF183 sono tra le più frequentemente utilizzate per identificare la contaminazione fecale umana associata 3.
Tuttavia, i risultati qPCR possono spesso essere prevenuto perché si basano su curve standard per la quantificazione. qPCR quantifica le concentrazioni sconosciute di bersaglio nei campioni interpolando il loro ciclo di quantificazione (CQ) da una stanCurva dard che descrive una relazione lineare tra Cq e quantità logaritmica di una serie di norme in serie diluiti. La mancanza di materiale di riferimento standard affidabile e coerente può quindi notevolmente BiAS risultati qPCR. Gli studi hanno dimostrato che i risultati qPCR differivano di circa mezzo di registro utilizzando standard di diversi fornitori di 4 e 2 volte con diversi lotti di standard dello stesso fornitore 5.
La tecnologia digitale PCR (dPCR) quantifica un campione sconosciuto contando la frequenza di positivi in un gran numero di PCR in miniatura che vengono generati dal partizionamento di un qPCR massa in migliaia o milioni di nanolitro uniforme o reazioni picolitri 6. E 'indicato come gocciolina PCR digitali (cioè, questo articolo) o camera PCR digitali, rispettivamente se le partizioni sono acqua-in-olio gocce (ovvero questo articolo) o piccole camere su un chip. Una concentrazione più elevata del campione comporterà presenza di DNA bersaglio(PCR quindi positivo) in una proporzione maggiore di partizioni, una relazione approssimata dalla distribuzione di Poisson. Come tali, i risultati binari (PCR positiva o negativa) sono registrate e la frequenza delle goccioline positivi viene utilizzato per calcolare le concentrazioni dei campioni sconosciuti direttamente tramite Poisson approssimazione, eliminando la necessità di una curva standard come in qPCR.
Questa natura binaria di quantificazione PCR digitale offre vantaggi supplementari rispetto qPCR 7. Poiché l'amplificazione ritardato può ancora produrre un PCR positivo, dPCR quantificazione è più robusto contro l'inibizione che riduce l'efficienza di amplificazione. Analogamente, dPCR quantificazione non è influenzato dalla variabilità dei valori Cq come qPCR, portando ad una maggiore precisione di dPCR rispetto al qPCR 8-10.
Inoltre, il processo di partizionamento assicura una piccola quantità di DNA bersaglio presente in ogni gocciolina, minimizzando efficace concorrenza substrato (durante amplification di differenti target di DNA) che sono ostacoli comuni al raggiungimento fronte-retro (cioè un saggio misura contemporaneamente due obiettivi di DNA) in qPCR. Come tale, eseguita in duplex o simplex (cioè un target viene misurato in un singolo test) dPCR produce quantificazione quasi indistinguibile di entrambi gli obiettivi 7,11.
L'obiettivo del test PCR digitale (EntHF183 dPCR) descritto in questo articolo è quello di ottenere una quantificazione diretta simultanea dell'indicatore fecale generale Enterococcus spp. E il marcatore HF183 umano-fecale associata con una migliore precisione, la riproducibilità e la robustezza contro l'inibizione rispetto al suo qPCR controparti. Questo test è stato utilizzato con successo per quantificare la contaminazione fecale in acqua dolce ambientale, acqua marina, e vario materiale fecale 7, ma può anche essere applicato a qualsiasi altro tipo di acque e acque di scarico. Questo test rappresenta una grande promessa per l'analisi di sedimenti o suoli a causa di essas elevata tolleranza alla inibizione, ma ulteriori test è necessario a causa della complessità di inibitore mescola in questi tipi di campioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono alcuni passaggi critici nel protocollo. In primo luogo, la miscelazione delle miscele test può essere difficile, perché il master mix è più viscoso rispetto ai tradizionali Master Mix qPCR. Semplice vortex può portare a scarsa miscelazione, che a sua volta porta alla distribuzione non uniforme dei modelli di DNA nelle miscele di saggio e successivamente nelle goccioline. La tecnica di miscelazione-by-pipettaggio descritto nel protocollo deve essere seguita per garantire accurata quantificazione dPCR. In sec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | For storage of reagents, samples/production of master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | For initial master mix and sample inoculation |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | To seal sample plate |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20uL pipet tips | Rainin | GP-L10F | For tansferring sample/master mix to cartidge |
| 200uL pipet tips | Rainin | GP-L200F | For transferring droplets to final Twin.Tec Plate |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | For final droplets thermal cycling and reading |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | To seal Twin.Tec plate before thermalcycling |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | Only the thermal cycler is needed, no optics |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 and C1000 | |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | i.e. the digital PCR mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternative vendor can be used |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternative vendor can be used |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternative vendor can be used |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternative vendor can be used |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] |
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. |
| Positive control | Mixture of E.faecalius genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalius and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA. |
References
- Boehm, A. B., et al. Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study. Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).
- Layton, B. A., et al. Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study. Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).
- Cao, Y., et al. Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods. Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).
- Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples. J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).
- Huggett, J. F., et al. The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).
- Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment. Water Res. 70, 337-349 (2015).
- Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification. Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).
- Whale, A. S., et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR. PLoS One. 8 (5), e62583 (2013).
- Cao, Y., et al. Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste. Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).
