母体免疫激活（MIA）是自闭症和精神分裂症环境风险因素的一种模型。本文旨在提供在妊娠小鼠中诱导MIA的逐步操作流程，以提高该模型的可重复性。
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方法文章
使用病毒模拟物聚胞苷酸在妊娠中期诱导小鼠母体免疫激活
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
母体免疫激活（MIA）模型作为一种模拟多种精神疾病环境风险因素的啮齿类动物模型，日益受到重视。大量研究表明，MIA模型在自闭症和精神分裂症相关研究中具有良好的表型效度、构念效度和预测效度。为了建立MIA模型，研究人员通常使用病毒模拟物——聚胞苷酸：聚肌苷酸（poly(I:C)）来激活妊娠期啮齿类动物的免疫系统。一般而言，经免疫激活母体所产的子代会表现出与自闭症和精神分裂症相关的行为异常和生理改变。然而，不同剂量和不同时间点注射poly(I:C)可能在脑发育的不同阶段产生干扰，从而导致不同的结果。本文提供了一种在妊娠中期胚胎12.5天（E12.5）通过腹腔（i.p.）注射20 mg/kg poly(I:C)诱导MIA的详细方法。该方法已被证实可在母体-胎盘-胎儿轴线上引发急性炎症反应，最终导致与自闭症和精神分裂症相关的大脑功能紊乱及行为表型。
引言
母体免疫激活（MIA）的概念源于关于母体感染与自闭症及精神分裂症关联的流行病学研究1。由于在母体病毒感染后，胎盘或胎儿大脑中均未检测到可复制的病毒病原体2,3，因此推测感染对子代的影响是由母体免疫系统的激活所致，而非病原体本身直接引起。
为了阐明母体免疫激活（MIA）与精神疾病之间的因果关系，向妊娠期啮齿类动物体内注射化学合成的、模拟病毒的双链RNA——聚肌苷酸:聚胞苷酸（poly(I:C)）——已被广泛用作MIA的动物模型4,5。Poly(I:C)可被Toll样受体3（TLR3）识别，其全身给药可诱导类似病毒感染的急性炎症反应。Poly(I:C)导致子代出现行为异常和神经病理改变的机制之一，是引起母体-胎盘-胎儿轴中促炎与抗炎细胞因子的失衡6。多个研究团队已采用MIA模型来探究精神疾病的病因7，由于不同研究团队的关注点各异，已使用多种不同的免疫激活时间点，以实现对大脑发育和行为产生不同的干扰效应7。
加州理工学院 Paul H. Patterson 实验室采用在胚胎发育第12.5天（E12.5）向怀孕小鼠注射聚肌胞苷酸（poly(I:C)）的策略，已成功证明母体免疫激活（MIA）可诱导子代出现与自闭症和精神分裂症相关的行为、神经及免疫学改变8-11。我们先前的研究表明....
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方案
所有实验方案均经加州理工学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准后实施。
1. 准备定时交配对
- 行为学实验至少使用6只母鼠，基因表达分析使用3只。
注意：应使用估计数量两倍的雌性小鼠，因为定时交配后仅有约50%的小鼠会形成阴栓。 - 使用无既往妊娠史、年龄在8至16周之间的雌性小鼠。
注意：曾与雄性小鼠发生过性接触但未妊娠的雌性小鼠也可接受。 - 将雌性小鼠共同饲养，并将笼子并排放置，以同步其动情周期。使用高度超过5.5英寸、内部底面积为75平方英寸的标准小鼠笼，可容纳5只成年小鼠。使用耳标法对每只雌性小鼠进行标记。
2. 设置定时交配对
- 在黑暗周期开始前0-2小时设置定时交配。每笼放入两只雌性小鼠。取出小鼠并分别称重。记录每只雌性小鼠的体重。
- 将一只雄性小鼠放入每笼与两只雌性小鼠共同饲养。采用三只交配法以尽量减少父系混杂效应。
3. 阴道栓检查（E0.5）
- 在暗周期结束后的0-4小时内检查雌性小鼠。轻轻抓住雌性小鼠尾部基部，使其能够抓住金属网格、笼盖或笼子边缘。
- 寻找阴道栓存在的迹象：阴道栓表现为阴道开口处可见的白色团块。若栓塞不明显，可将200 µl移液器吸头....
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结果
在E12.5时注射20 mg/kg聚肌胞苷酸（poly(I:C)）可诱发母体-胎盘-胎儿轴的急性炎症反应，并引发对脑发育和行为表型的慢性影响12,13. 促炎性细胞因子白细胞介素（IL）-6水平升高是MIA后急性炎症反应的可靠指标。其峰值时间 Il6 胎盘和胎儿大脑中的基因表达在注射聚肌胞苷酸（poly(I:C)）后3小时进行检测12,13我们已证明，poly(I:C) 可诱导出更高的 Il6 母体脾脏-胎盘-胎儿大脑间的基因表达图5）（数据改编自 Wu 等, 2015)13研究人员可将此范式与其他治疗方法相结合，以研究可能改变MIA后急性炎症反应的因素， 例如， 母体饮食、遗传突变小鼠、抗炎药物 等等.
另一方面，行为学改变也是母体免疫激活（MIA）模型的重要特征.......
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讨论
在不同时间窗口诱导母体免疫激活（MIA）会干扰啮齿类动物大脑发育的不同事件，从而导致子代出现不同的行为异常和神经病理学改变。本文描述了一种在胚胎发育第12.5天（E12.5）通过注射聚肌苷酸：聚胞苷酸［poly(I:C)］在小鼠中诱导MIA的实验方案。该MIA诱导方法可导致子代出现与自闭症和精神分裂症相关的行为、神经、免疫及胃肠道异常8,10,11,16。需要注意的是，由于MIA是一种环境风险因素，子代表型的变异程度预期会高于神经发育障碍遗传模型小鼠。因此，为了通过MIA稳定且可重复地产生与自闭症和精神分裂症相关的表型，尤其重要的是要尽量减少可能干扰实验结果的额外变量。
应严格遵循本方案中描述的时间线。正确的注射时间窗口可确保母体免疫激活（MIA）在子代大脑发育的特定阶段产生干扰。在小鼠中，E12.5 时期诱导 MIA 相当于人类妊娠第一孕期末期的干扰阶段21，此阶段发生显著的大脑发育过程，包括浦肯野细胞和尾状壳核的发育，以及皮质层的神经发生。未来还需进一步研究，以证实 MIA 小脑中浦肯野细胞丢失与早期脑发育干扰之间的关联。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们谨向已故的 Paul H. Patterson 博士致以敬意，以表彰他在线粒体功能障碍（MIA）模型、自闭症及精神分裂症研究领域所做出的重要贡献。我们感谢 Sarkis K. Mazmanian 对本实验方案的大力支持；感谢 Ruben M. Bayon、Yvette Garcia-Flores、Karen C. Lencioni 和 Leslie A. Neumann 提供的行政协助；感谢 Ali Khoshnan 和 Jan C. Ko 在拍摄过程中提供的帮助；感谢 Elaine Y. Hsiao 和 Natalia Malkova 在 MIA 诱导方面的建议；感谢 Jeffrey S. Cochrane、Joaquin Gutierrez、Kwan F. Lee、Jaime Rodriguez、Lorena C. Sandoval 和 Natalie A. Verduzco 在动物饲养管理方面的专业支持。本研究得到了以下资助：NIH Conte 中心奖（NIH 5P50MH086383-04，授予 Paul H. Patterson）；Autism Speaks 基金（#7670，授予 Paul H. Patterson）；Simons 基金会（#322839，授予 Sarkis K. Mazmanian）；NIH 培训基金（NIH/NRSA T32GM07616，授予 K.-H.C.）；加州理工学院暑期本科生研究奖学金（SURF，授予 Z.Y.）；加州理工学院 Amgen 学者项目（授予 Z.Y.）；以及中国台湾国家科学委员会博士后奖学金（NSC 101-29....
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚肌苷酸–聚胞苷酸钾盐 | SIGMA | P9582 | |
| 0.9% 氯化钠注射液 USP | HOSPIRA | NDC 0409-4888-10 | |
| MONOJECT 胰岛素注射器 3/10 ml 29 G x 1/2" | COVIDIEN | 8881600145 | |
| 50 ml 锥形螺口管 | USA SCIENTIFIC | 1500-1211 | |
| Nanodrop 1000 分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | 1000 | 可选 |
| 体视显微镜 | Wild Heerbrugg | M5A | 可选 |
| Dumont #5 镊子，不锈钢尖端，尺寸 0.10 × 0.06 mm | Roboz | RS-5045 | 可选 |
| RNAlater RNA稳定试剂 | Qiagen | 76104 | 可选 |
| TRIzol试剂 | Life Technologies | 15596-026 | 可选 |
| RQ1 无RN酶的DNase | Promega | M610A | 可选 |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | 170-8891 | 可选 |
| FastStart universal SYBR green master mix with ROX | 罗氏 | 4913922001 | 可选 |
| 实时荧光定量PCR | ABI | 7300 | 可选 |
| 引物：Il6 正向 | Life Technologies | TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC | 可选 |
| 引物：Il6 反向 | Life Technologies | TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC | 可选 |
| 引物：β-actin 正向 | Life Technologies | AGAGGGAAATCGTGCGTGAC | 可选 |
| 引物：beta-actin 反向 | Life Technologies | CAATAGTGATGACCTGGCCGT | 可选 |
| MicroAmp 光学 96 孔反应板 | Life Technologies | 4306737 | 可选 |
| MicroAmp 光学粘性封膜 | Life Technologies | 4311971 | 可选 |
| EthoVision | Noldus | EthoVision | 可选 |
| SR-LAB装置（PPI） | 圣迭戈仪器公司 | SR-LAB | 可选 |
| 弹珠 | PENN-PLAX | 蓝色宝石弹珠 | 可选 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | Life Technologies | 21600-069 | 可选 |
| 多聚甲醛 | MACRON | 2621-59 | 可选 |
| 振动切片机 | Leica | VT1000 S | 可选 |
| 叠氮化钠 | Sigma | S2002 | 可选 |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | 可选 |
| 过氧化氢溶液 | Sigma | 18312 | 可选 |
| 山羊血清 | Vector Laboratories | S-1000 | 可选 |
| 兔抗钙结合蛋白抗体 | Abcam | ab11426 | 可选 |
| 生物素标记的山羊抗兔IgG抗体 | Vector Laboratories | BA-1000 | 可选 |
| VECTASTAIN ABC 试剂盒 | Vector Laboratories | PK-4000 | 可选 |
参考文献
- Brown, A. S. Epidemiologic studies of exposure to prenatal infection and risk of schizophrenia and autism. Dev Neurobiol. 72 (10), 1272-1276 (2012).
- Fatemi, S. H., et al.
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