Summary
Astrocytter er en af de vigtigste centrale aktører i centralnervesystemet (CNS). Her bliver vi rapporterer en praktisk metode til kønsbestemt hippocampus astrocyt kultur protokol for at studere mekanismerne bag astrocyt funktion i mandlige og kvindelige nyfødte hvalpe efter in vitro-iskæmi.
Abstract
Astrogliose efter hypoxi / iskæmi (HI) -relateret hjerneskade spiller en rolle i øget morbiditet og mortalitet hos nyfødte. Nylige kliniske undersøgelser indikerer, at sværhedsgraden af hjerneskade synes at være sex afhængig, og at de mandlige nyfødte er mere modtagelige for virkningerne af HI-relateret hjerneskade, hvilket resulterer i mere alvorlige neurologiske udfald sammenlignet med kvinder med sammenlignelige hjerneskader. Udviklingen af pålidelige metoder til at isolere og fastholde højt beriget populationer af kønsbestemt hippocampus astrocytter er vigtigt at forstå den cellulære grundlag af kønsforskelle i de patologiske konsekvenser af neonatal HI. I denne undersøgelse beskriver vi en metode til at skabe sex specifikke hippocampale astrocytkulturer, som udsættes for en model af in vitro iskæmi, oxygen-glucose deprivation, efterfulgt af reoxygenering. Efterfølgende reaktiv astrogliose blev undersøgt ved immunostaining for gliafibrillært surt protein (GFAP) og S100B. Denne metode giver et nyttigt værktøj til at studere den rolle, mandlige og kvindelige hippocampus astrocytter efter neonatal HI, hver for sig.
Introduction
Astrocytter er en af de vigtigste centrale aktører i centralnervesystemet (CNS). Voksende mængde data viser, at de roller, astrocytter er mere end at levere neuronal støtte. Faktisk kan roller astrocytter under fysiologiske betingelser være meget kompleks, såsom styring af migrationen af udviklingslandene axoner 1, regulering CNS blodgennemstrømning 2, opretholdelse af pH homeostase af den synaptiske interstitiel væske 3, og deltage i blodhjernebarrieren 4 og synaptisk transmission fem. Under patologiske tilstande, astrocytter svare skade med en proces, der kaldes reaktiv astrogliose hvori morfologi, antal, placering, topografi (med hensyn til afstanden fra insult) og funktion af astrocytter kan ændre sig på en uensartet måde 6,7. Astrogliose set efter neonatal hypoksisk iskæmisk encephalopati måske bidrage til sygelighed og dødelighed af nyfødte Nylige kliniske og eksperimentelle undersøgelser indikerer, at sværhedsgraden af hjerneskade synes at være sex-afhængige, og at de mandlige nyfødte er mere modtagelige for virkningerne af hypoxi / iskæmi (HI) -relateret hjerneskade, hvilket resulterer i mere alvorlige neurologiske udfald sammenlignet med hunner med sammenlignelige hjerneskader 9-11. Selv lokaliseringen af skaden afhænger gestationsalder og varigheden og sværhedsgraden af den fornærmelse, hippocampus er en af de mest almindeligt udføres regioner i CNS efter udtrykket neonatal HI og forøget hippocampal astrogliose er blevet bekræftet ved opregulering af glial fibrillært surt protein (GFAP) 3 d efter neonatal HI 7,10,12,13. Kønsforskelle i astrocyt-funktion blev vist i både nyfødte og voksne gnavere efter cerebral iskæmi 14,15. Desuden blev mandlige astrocytisk modtagelighed for in vitro iskæmi vist ved øget cell død i forhold til kvindelige kortikale astrocytter i kultur 16. Kønsforskelle starte i-utero og fortsætter indtil døden 17. I det seneste årti, har vigtigheden af at inddrage kønnene i eksperimentelle forhold i cellekultur og in vivo studier lagt vægt for Institut for Medicin og NIH til at søge grundlæggende viden i kønsforskelle ses i fysiologiske og patologiske tilstande 17,18 . Udvikling af pålidelige metoder til at isolere og opretholde populationer af kønsbestemt hippocampus astrocytter er vigtigt at forstå den cellulære grundlag af kønsforskelle i de patologiske konsekvenser af neonatal HI. Den foreliggende undersøgelse er designet til at give de teknikker til at forberede berigede kønsspecifikke hippocampus astrocytkulturer fra nyfødte mus for at vurdere de roller GFAP-immunoreaktive astrocytter efter Oxygen / Glucose Berøvelse (OGD) og reoxygenering (REOX), overtalelseHI i cellekultur miljø. Denne teknik kan anvendes til at afprøve nogen hypotese vedrørende hippocampale astrocytter i neonatale hanner og hunner under normoxiske og iskæmiske tilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med anbefalingen af vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institute of Health. Dyret Protokollen blev godkendt af University of Wisconsin-Madison, Institutional Animal Care og brug Udvalg. Primær astrocyt Culture protokol, der præsenteres her er adopteret fra de protokoller, præsenteret af Zhang Y 19 et al. Og Cengiz P 20 et al. Med nogle ændringer.
1. Hippocampal Dissektion og astrocyt Kultur
- Forbered alle nødvendige reagenser og materialer, herunder kirurgiske sakse, glatte fine pincet, flad spids pincet, papirhåndklæder, affald taske, 70% ethanol og 2 dissekere retter (3,5 cm i diameter) på is fyldt med 2 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) hver . Sørg for, at kirurgisk udstyr er er sterile (autoklave) før proceduren og bruge alle andre materialer (astrocyt plating medium: DMEM + 5% hesteserum +1% penicillin-streptomycin, hesteserum, HBSS, 0,25% trypsin, dækglas, petriskåle, 15/50 ml rør, T25-flasker, etc.) som præ-steril.
- Hold forsigtigt og spray hoved og hals af mus hvalp med 70% ethanol og halshugge bruge skarpe steril saks [Figur 1 (1)].
- Udfør en midtlinjeincision fra posterior til anterior skull with lille saks langs hovedbunden for at blotlægge hjernen [Figur 1 (2-3)].
- Skær kraniet omhyggeligt fra halsen til næsen med en lille saks. Derefter skæres kraniet anterior til de olfaktoriske pærer og ringere lillehjernen at afbryde kraniet fra kraniet base.
- Lav et lille indsnit ved basis af kraniet og skåret langs midterlinjen. Brug sterile flat-tip pincet til at skrælle væk kraniet. Fjern hjernestammen ved hjælp af en buet pincet. Fjern hjerne fra kraniet og anbringes i den første dissekere fad [Figur 1 (4-9)] 21.
- Ved hjælp af en buet pincet, flip hjernen, således at den ventrale overflade af hjernen vender opad, og derefter adskille begge halvkugler med en skarp steril kirurgisk kniv [Figur 1 (10,11)]
- Skræl tilbage hjernehalvdele og forsigtigt fjerne svulmende midthjernen og thalamiske væv med en steril flad buede pincet til at afsløre hippocampus, en lille, søhest-formet struktur i den mediale tindingelappen [Figur 1 (12-14)].
- Fjern både de hippocampus lapper [Figur 1 (15,16)] og omhyggeligt dissekere meninges fra lapper ved at trække med de fine pincet. Dette trin undgår forurening af det endelige astrocyt kultur ved meningeal celler og fibroblaster.
- Overfør de forberedte hippocampus lapper ind i den anden skål fyldt med HBSS og returnere den på is [Figur 1 (17,18)]. Pool både hippocampus lapper fra en enkelt mus (P0 - P2) til udarbejdelse af flodhestCAMPAL astrocytkulturer. Dette giver astrocyt korrekt tæthed. Hakke hippocampus lapper ved hjælp af en skarp steril kirurgisk kniv (ca. 4 gange).
- Aspirer HBSS fra skålen ved anvendelse af en steril spids fastgjort til en 1 ml pipette og tilsæt 3 ml 0,25% trypsin, blandes og overføres til en 15 ml sterilt konisk rør og inkuberes vævet ved 37 ° C i 20 minutter under forsigtig omrystning.
- Centrifugerør ved 300 xg i 5 min. Aspirer supernatanten forsigtigt med en steril glaspipette fastgjort til en vakuumledning. Tilsæt 10 ml astrocyt plating medium og tritureres (20 - 30 gange) ved hjælp af en brand poleret glas pipette indtil væv stykker homogeniseres.
- Centrifugerør ved 300 xg i 5 min. Aspirer supernatanten og tilsættes 2 ml frisk forvarmet astrocyt plating medier. Pass celler gennem en 70 um masker (celle si) i en ny 50 ml konisk rør.
- Plade hele cellesuspension på en Poly-D-Lysin / lamininovertrukne steril T25 dyrkningskolbe indeholdende 3 mlastrocyt plating media, derefter inkuberes kolben ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator.
- Aspirer hele medier på dag- jeg n-vitro (DIV) 1, DIV 3 og DIV 7, og erstatte med 2 ml frisk astrocyt plating medier. Observere progression og astrocytisk sammenløb under lysmikroskop hver gang under udskiftningen af astrocyt plating medier.
BEMÆRK: I DIV 1, er alle de levedygtige astrocytter bundet til overfladen af kulturen kolben og de døde eller døende celler, der omfatter neuroner er flydende i supernatanten. På DIV 3, de vedhæftede celler begynder at dele sig for at danne astrocytisk cellelag. I mangel af de støttende forhold, kultur er næsten blottet for enhver neuronal vækst. På DIV 7, astrocyt lag er omkring 80 - 90% konfluente og et par mikroglia samt oligodendrocyt precursorceller er til stede på toppen af astrocytisk lag. - Aspirer klædningen medium fra kolben, tilsættes 2 ml frisk forvarmet astrocyt plating medium, skylles ennd fjerne igen på DIV 11, når astrocytter er sammenflydende og klar til sub dyrkning.
- Tilsæt 2 ml 0,25% trypsin, forsigtigt rotere kolben et par gange og aspirat trypsin ved hjælp af en steril glas pipette.
- Tilsæt 2 ml 0,25% trypsin og lad kolben sidde i vævskultur hætte til 4. - 5. minutter ved stuetemperatur.
- Fjern trypsin og kolben holde ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i 10 min. Tilsæt 5 ml forvarmet astrocyt plating medium og tag astrocytiske lag ved at trykke på kolben mod håndfladen (3 - 4 gange) efterfulgt af blid findeling at opnå fuldstændig løsrivelse og indsamle astrocytter i en 15 ml konisk rør.
- Centrifugerør ved 300 xg i 5 min, aspireres supernatanten, og der tilsættes 1 ml frisk astrocyt plating medium.
- Der tilsættes 10 pi af cellesuspensionen til et hæmocytometer og tælle cellerne i det store centrale inddelte areal (1 mm 2) ved anvendelse af en inverteret fasekontrastmikroskop (10X objektiv). Multiply med 10 4 at estimere antallet af celler pr ml. En T25-kolbe vil give ~ 1 x 10 6 total dissocieres celler. Frø ~ 1 x 10 5-celler i 2 ml astrocyt udpladningsmedium på en 12 mm diameter Poly-D-Lysin præcoatede dækglas i brønden af en 24-brønds dyrkningsplade.
- Der inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator. Udfør OGD / REOX på DIV 12-14 (afsnit 2).
- Behandl astrocytkulturer ved DIV 3 med 5 mM L-leucin-methylester (LME) hydrochlorid indtil DIV 11 hvis der ønskes hippocampuskulturer blottet for mikroglia. Efter LME inkubation til underlagt kulturer til at ryste (300 rpm i 1 time) fjernelse af forurenende mikroglia.
BEMÆRK: LME er en mikroglial cytotoksisk middel, som er blevet anvendt i udstrakt grad som en metode til at fjerne prolifererende microglia 22.
2. OGD / REOX Behandling
- Aspirer medier fra dækglas, der indeholder klæbende astrocyt kultur (DIV 12-14) og skyl 3 gangeved forsigtigt at dreje 24 brønde dyrkningsskål holde dækglasset et par gange med 1 ml isotonisk OGD opløsning (pH 7,4) indeholdende (i mM): 0 glucose, 21 NaHCO3, 120 NaCl, 5,36 KCI, 0,33 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 1,27 CaCl2, og 0,81 MgSO4.
- Tilsæt 0,2 ml OGD løsning på godt dække dækglasset og inkuberes i 2 timer i en hypoxisk inkubator indeholdende 94% N2, 1% O2 og 5% CO2. Bland forsigtigt med en orbitalryster (50 rpm) i de første 30 min af hypoxi at lette gasudveksling.
- Inkuber normoksiske kontrolceller i 2 timer i 5% CO2 og atmosfærisk luft i en puffer identisk med OGD løsning bortset fra tilføjelsen af 5,5 mM glucose.
- For REOX, aspireres OGD løsning og tilsæt 2 ml astrocyt plating medium. Inkuber i 5% CO2 og atmosfærisk luft ved 37 ° C i 5 timer.
3. immuncytokemisk farvning </ P>
- Aspireres dyrkningsmedierne anvendelse af en steril glaspipette fastgjort til en vakuumledning og hurtigt skylle dækglas gang ved tilsætning af 1 ml 0,1 M Tris saltvand (TBS) (154 mM NaCl, 16 mM Trizma Base, 84 mM Tris-HCI, pH 7,4) til brønden. Aspirer og tilsættes 2 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x phosphatpufret saltvand (PBS). Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer og tilsættes 1 ml 0,1 M TBS, og derefter placere på en vuggende shaker i 2 min. Gentages 3 gange. Tilsæt 1 ml blokerende opløsning (10% gedeserum, 10 mg / ml BSA, 0,025% Triton X-100 i 0,1 M TBS) og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C på en rokkende ryster.
- Aspirer blokeringsopløsning og tilføj muse monoklonale primære anti-GFAP-antistof (0,2 ml af en 1: 500 fortynding i blokeringsopløsning) og kanin polyklonalt anti-S100B (1: 500) eller kanin polyklonalt anti-HIF1α (1: 200) i 60 minutter ved 37 ° C på en rokkende ryster.
- Alternativt er nogle astrocytter inkuberes med kanin polyklonalt anti-IBA1 (1: 200) og muse monoclonal anti-MAP2 at få adgang kultur renhed.
- Aspirer primært antistof og skyl dækglas ved tilsætning af 1 ml 0,1 M TBS og anbringelse på en vippende rysteapparat i 2 min og derefter aspirat. Gentag to gange.
- Tilsæt 0,2 ml af en 1: 200 fortynding af sekundært gede-anti-kanin 488-konjugerede og anti-muse 568-konjugerede antistoffer i blokeringsopløsning i 60 minutter ved 37 ° C på en rokkende ryster.
- Aspirer sekundært antistof og skyl dækglas ved tilsætning af 1 ml 0,1 M TBS og sted på en vippende rysteapparat i 2 min og derefter aspirat. Gentag to gange.
- Fjern dækglas fra godt og tørt ved at placere på et dias placeret på en slide-tørrere. Mount dækglas på et nyt dias ved at vende på en enkelt dråbe Vectashield hardset montering medium med DAPI (1,5 ng / uL).
- Billeddata dækglas på et konfokalt mikroskop under anvendelse af enten 20X tør eller 60X olie mål. Anskaf billeder (512 x 512) for DAPI (405 nm ex / 450 nm em) og fluorokrom 488 mærkede GFAP antistof (488 nm ex / 515 nmem). Hold erhvervelse parametre konstant inden 20X og 60X grupper.
4. Køn Bestemmelse Brug PCR
- Varme pup tå eller finger udklip ved 95 ° C i 45 minutter i 50 mM NaOH og neutraliseres med tilsvarende volumen af 1 M Tris, pH 6,8.
- Tilsæt 1 pi af den ekstraherede DNA-opløsning til 19 pi af følgende blanding: 5 pmol af primere for de Myog og SRY gener, 1x reaktionspuffer, 0,2 mM af hver deoxynukleotid og 8 U Taq-polymerase.
- Brug primere sekvenser; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' og Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 ', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3' 23.
- Udfør følgende PCR protokol: 95 ° C i 3 minutter, derefter 30 cyklusser med denaturering ved 95 ° C i 15 s, annealing ved 58 ° C i 15 s, og forlængelse ved 72 ° C i 1 min. Efter denne 30 cykler, reaktionen afsluttes med en endelig 72 ° C forlængelse i 1 minut.
- separat PCR produkter elektroforetisk på en ethidiumbromid-indeholdende 2% agarosegel og visualisere under UV-belysning. (Figur 2A). FORSIGTIG! Ethidiumbromid er et potentielt kræftfremkaldende og skal håndteres forsigtigt og bortskaffes korrekt som pr institutionens regler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forståelse af roller kønssorteret astrocyt funktioner under fysiologiske eller patofysiologiske betingelser er blevet uhyre belyst ved dyrkning af disse celler under in vitro betingelser. Det vigtige aspekt ved udførelse kønsbestemt dyrkning er at bestemme kønnet af muse pup før dens anvendelse. Vi bestemt køn musen genetisk ved PCR og ved visuel vurdering (figur 2) 16. Metoden til kønsbestemmelse ved hjælp af PCR blev vedtaget med ændringer fra McClive og Sinclair, er hurtig, enkel og meget reproducerbar metode 23. Figur 2A viser repræsentative resultater af kønsbestemmelse ved hjælp af PCR. PCR-produkter blev genereret med DNA ekstraheret fra to repræsentative P1 mandlige og kvindelige hale klip. Reaktionen omfatter multiplexede primerpar for Sry og Myog gener, der genererer mandlige specifikke bånd af 441 bp og kvindelige specific bånd på 245 bp, hhv. Visuel bestemmelse af neonatal (P 1 - 3) mus sex med blotte øje blev etableret ved at lede efter tilstedeværelsen af små formørket stedet mellem anogenitale åbninger kun mænd (figur 2B) 16,24.
Selv dyrkning af astrocytter er praktisk og relativt let at etablere under laboratoriet sat op, kan denne fordel blive hæmmet af sin forurening primært med mikroglia eller neuroner i mindre omfang. Kontamination af astrocytter kan let bestemmes ved immunolabeling af de dyrkede celler med cellespecifikke markører for enten mikroglia (IBA1) eller neuroner (MAP2). I den foreliggende undersøgelse blev der observeret hippocampale astrocytter vokser i primære monolagskulturer at have ~ 6% af kontaminerende mikroglia på DIV 14, som foreslået af nogle få celler, der udtrykte IBA1 (figur 3). Tværtimod blev ingen af cellerne sig at udtrykke MAP2 tyderkulturen var fuldstændig blottet for enhver neuronal kontaminering (figur 3). Den mindre mikroglial forurening observeret i vore kulturer, er i overensstemmelse med andre rapporter, hvori forfatterne rapporterede en 5% mikroglial kontaminering i deres primære kortikale astrocytkulturer afledt fra 1 - 3-dage gamle museunger 25. Astrocytter besidder en specifik cytoarchitecture der tillader dem at reagere på ændringer i deres mikromiljø herunder hypoxi. For at bestemme nogen sex specifik astrocytisk respons på in vitro iskæmi, vi udsat kønssorteret hippocampus astrocytter til OGD / REOX. Vellykket induktion af OGD / REOX blev bestemt ved forøget nuklear ekspression af hypoxi inducerbar faktor 1 alfa (HIF1α observeret i GFAP + astrocytter udsat for 2 timer OGD efterfulgt af 5 h REOX sammenlignet med HIF1α udtryk i celler under normoxiske betingelser (Figur 4 ).
(figur 5). GFAP og S100B blev colocalized i cytoplasmaet og celle organer astrocytter, der kendetegner en modnet astrocytisk udviklingsstadiet, hvor disse celler tendens til at miste deres neural stamcelle (NSC) potentiale 26. Morfologi og tæthed af GFAP eller S100B immunoreaktiviteter var ens i både mandlige og kvindelige astrocytkulturer som observeret i deres respektive normoxisk og OGD / REOX behandlingsgrupper. Under normoxiske betingelser, hippocampale astrocytter præsenteret en polygonal at tenformet og flad morfologi [Figur 5A, B (normoksi 60X; pil)], som vurderet ved anvendelse af konfokal mikroskopi. Disse celler var i stand til at dele sig, indtil sammenflydende i ca. 2 uger før induktionen af OGD / REOX. Efter 2 timer OGD og 5 timer REOX, astrocytter udstillet klassiske reactive astrocyt morfologi vise tilbagetrukne primære processer, hypertrofi af soma og processer, og forøget ekspression af GFAP eller S100B [Figur 5A, B (OGD / REOX, 60X, pilespids)]. Efter OGD / REOX, GFAP / S100B-farvning udviste også en omfattende meshwork strækker sig tværs cytoplasmaet i både mandlige og kvindelige hippocampus astrocytter. Manglende GFAP-farvning observeret i de dyrkede hippocampale astrocytter fra GFAP null mus tjente som en negativ kontrol (figur 5B, indsat). Ovenstående resultater giver direkte bevis for, at morfologi GFAP / S100B-immunoreaktive astrocytter foretages væsentlige ændringer når det udsættes for OGD-REOX.
Figur 1. Præsentation af hippocampus Removal Teknik fra P1 Mus. 1. Halshugge hvalp at fjerne hovedet.2, 3. Brug fine saks, lave en midtlinie incision i huden, til bageste anterior, og skrælle huden ved hjælp af en flad-spids pincet. 4, 5, 6. Lav et lille snit i bunden af den kranium. Skær kraniet langs midterlinjen og skræl væk to halvdele for at blotlægge hjernen. 7, 8. Fjern cerebellum ved hjælp af en buet pincet. 9. Fjern forsigtigt hjerne fra kraniet og anbringes i en steril petriskål. 10, 11. Flip hjernen, således at den ventrale overflade af hjernen vender opad ved hjælp af en buet pincet, derefter adskille begge halvkugler med en skarp steril kirurgisk kniv. 12, 13, 14. Fjern svulmende midthjernen og thalamiske væv forlader intakte underliggende halvkugle og afslørende hippocampus. 15, 16. Fjern hippocampus (lille C-formet struktur). 17, 18. læg straks de hippocampus lapper opnået fra begge halvkugler i en separat petriskål indeholdende steril HBSS. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Sex Bestemmelse af neonatale mus. A. Mus sex var genetisk bestemt ved PCR med primere specifikke for Myog (X-kromosomet) og Sry (Y-kromosom) gener ved anvendelse af DNA ekstraheret fra finger eller tå udklip (F 1 M 1). Båndene af PCR blev visualiseret på en 2% agarosegel med ethidiumbromid under UV-belysning. F 2 og M 2 tjente som positive kontroller for kvindelige og mandlige hhv. B. Visuel bestemmelse af mand fra kvinde blev etableret ved at identificere en formørket plet mellem anogenitale åbninger (pil).urce.jove.com/files/ftp_upload/53695/53695fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Renhed af den primære Mouse Hippocampal astrocyt kultur. Immunfarvning af astrocyt kultur med neuronal markør MAP2 (rød) og mikroglia markør IBA1 (grøn). Kerner farves med 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (blå). Pilen angiver microglia kontaminering. Målestok:. 50 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. HIF1α Expression Var Ifoldet i dyrkede Hippocampal Astrocytter Udsat for OGD / REOX. Repræsentative immunfluorescerende billeder, der viser GFAP (rød) og HIF1α (grøn) mærkning i astrocytter udsat for (A) normoxi eller (B) OGD (2 timer) / REOX (5 timer). Kerner farves med 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (blå). Pil, lav HIF1α udtryk; pilespids, forhøjet HIF1α nukleare udtryk. Målestok:. 25 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. opregulering af S100B eller GFAP Expression i kønssorteret Hippocampal astrocytkulturer efter OGD-REOX. Kønssorteret dyrkede hippocampus astrocytter blev farvet for S110b eller GFAP udtryk under normoxiske betingelser eller efter 2h OGD efterfulgt af 5 timers REOX (OGD / REOX). Indsat: 60X billede fra hippocampus astrocytter dyrket fra GFAP null mus. Målestok: 30 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at studere kønsforskelle i egenskaber og funktion af astrocytter under fysiologiske og patologiske tilstande, udarbejdelse af kønssorteret primære astrocytter i cellekultur er et vigtigt redskab til at udnytte. I den foreliggende undersøgelse rapporterer vi en yderst effektiv og en reproducerbar metode til kultur en stærkt beriget homogen population af kønsbestemt hippocampale astrocytter fra nyfødte (P0-P2) C57BL / 6 (vildtype) eller K19F (GFAP null) museunger in vitro. Etableringen af denne metode hjælper undersøgerne forstå de fysiologiske og patologiske funktioner af kønsbestemt hippocampale astrocytter efter in vitro iskæmi.
Der er to vigtige trin i oprettelse denne metodik herunder bevarelse af sterilitet og passende fordøjelse af hippocampale lapper løbet trypsinbehandling efterfulgt af triturering af det fordøjede væv med henblik på at opnå den enkelt cellesuspension. Forebyggelse af primære astrocytter frafå forurenet er en af de største udfordringer i hele kulturen processen. Bakteriel og / eller svampe er to almindelige former for forurening, der kan gør de dyrkede celler ubrugelige, hvis ordentlig pleje ikke er vedtaget, mens de udfører teknikken. Derfor, for at sikre eksperimentel succes, er det bydende nødvendigt at udføre processen under en steril arbejde indstilling, der indbefatter, desinficering arbejdspladsen før brug, under anvendelse af sterilt kirurgisk udstyr og materialer, undgå kontakt af sterile materialer med ikke-sterile flader, ved anvendelse af en laminar flow hætte og undgå at tage reducerede dyrkningskolber ud af laminar hætte. Derudover under enzymatisk dissociation, kan længere inkubation af hippocampus væv med trypsin efterfulgt af grundig fysisk triturering føre til dens over-fordøjelse resulterer i dårlig cellelevedygtighed og ineffektiv fastgørelse af dissocierede celler til dyrkningskolber.
Tværtimod underdigestion af hjernevæv giver utilstrækkeligdissociation af gliaceller hvilket resulterer i dårligt udbytte og podning af celler som store klumper. Derfor, for at opnå sunde astrocytkulturer, er det nødvendigt at optimere trypsin koncentration, inkubationstid og triturering at opnå optimal fordøjelse af hippocampus væv. I vores hænder, inkubation af hippocampale lapper med arbejdsmiljøet koncentration på 0,25% trypsin i 20 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af blid triturering i 20 - 30 gange gav stærk vedhæftende, sunde og meget reproducerbar astrocytkulturer. Også, gentagen nedfrysning og optøning af reagenser før brug hver gang kan reducere deres effektivitet. Derfor er det meget vigtigt at alikvote reagenser i små ønskelige mængder og fryse. Opbevar f.eks trypsin, penicillin / streptomycin som 5 ml portioner og føtalt bovint serum som 50 ml portioner i talrige sterile koniske rør ved -20 ° C indtil anvendelse. Vi anbefaler ikke at bruge antibiotika efter udløbsdatoen.
GFAP er awell-karakteriseret markør af reaktive fibrøse astrocytter. Efter OGD / REOX, opregulering af GFAP-ekspression som reaktion på reaktiv astrogliose er blevet rapporteret 20. Selv om det er blevet foreslået, at GFAP overekspression kan anvendes som særligt mål for neuronal reparationsstrategier 27 dens rolle i hippocampal beskadigelse efter HI hos nyfødte er stadig uklar. Immunhistokemisk farvning af astrocytter med GFAP kan vi identificere og karakterisere disse celler under de fysiologiske og patologiske tilstande. GFAP farvning som enhver anden markør har nogle begrænsninger, der skal anerkendes. En af begrænsningerne ved GFAP-farvning af astrocytter er, at ikke alle astrocytter udtrykker GFAP under fysiologiske betingelser. Især den umodne astrocyt ekspression på GFAP ikke overstiger 40% under fysiologiske betingelser 28. Afhængigt af den alders- og typespecifikke brug af astrocytter, kan andre markører for valg betragtes som GLAST, ALDH1L1, BLBP, Aquaporin-4 og S100B 29.
Desuden tilstedeværelse af NSC'er forklædt som astrocytter i primære kulturer ikke kan udelukkes. Disse NSC'er har vist sig at præsentere fænotypiske og ultrastrukturelle karakteristika ligner modne astrocytter herunder afgivelse af GFAP. Derfor identifikation af molekylære markører, der er specifikke for fuldt differentierede og modnet astrocytter er et must. Astrocytter blev rapporteret til udtryk S100B på deres senere fuldt differentierede udviklingsstadier. For nylig er det blevet rapporteret, at neonatal kortikal GFAP + astrocytter mister deres stamfader stamcelle potentiale med indtræden af S100B-ekspression til at ske omkring DIV 15 26. Tilsvarende i vores dyrkningsbetingelser på DIV 14 blev 91% af GFAP-udtrykkende celler sig at co-udtrykker S100B, der tyder på, at kulturerne består af primært terminalt differentierede modnet hippocampus astrocytter.
Det er næsten umuligt at opnå rene primære hippocampale astrocytkulturer totalt blottet for kontaminerende mikrogliaceller der bor over og under astrocyt monolag. Derfor er det vigtigt at kende andelen af kontaminerende mikroglia i astrogliale kulturer og også for at holde denne andel så lav som mulig. I den foreliggende undersøgelse farves vi astrocytkulturer med mikroglia specifik markør IBA1 eller neuronal markør MAP2 for at bestemme tilstedeværelsen af eventuelle mikroglia eller neuroner som potentielle kontaminanter. Andelen af mikroglia i gnavere astrocyt kultur kan variere fra 1% til 30% afhængigt af flere faktorer, der omfatter dyr alder, art, region, dyrkningsmedium, subkultur fremgangsmåde og omrystning 30. I vores kulturer observerede vi ca. 6% af mikroglial forurening, der er sammenlignelig med andre rapporter 25. Hvis den påtænkte anvendelse af astrocyt kultur er at undersøge den rolle af hippocampale astrocytter i inflammation er det bydende nødvendigttil behandling kulturerne med 5 mM LME i 10 d for at fjerne eventuel mikroglial kontaminering i astrocytkulturer startende fra DIV 3. LME er en mikroglial cytotoksisk middel, som er blevet anvendt i udstrakt grad som en metode til at fjerne prolifererende microglia 20,22. Desuden bør LME-behandlede kulturer underkastes en rystning protokol (300 rpm i 1 time).
En anden teknisk udfordring i at udføre OGD / REOX er at afgøre, om der er opnået en tilstrækkelig grad af hypoxi at fremkalde astrogliose. Markører for hypoxi i astrocytter omfatter opregulering af GFAP og induktion af HIF-1α. Således i denne undersøgelse hypoksi blev bekræftet af stigningen i GFAP-immunreaktivitet (data ikke vist) og opregulering af HIF1-α-farvning (figur 4).
Sammenfattende opnået fra kønsbestemt neonatale hippocampale astrocytkulturer Resultaterne viste succesfuld cellebinding med sund homogen astrocyt lag displaying typiske morfologi på dækglas, og ekspressionen af den store reaktive astrocytiske markører GFAP og S100B efter induktion af in vitro iskæmi. Vi mener, at protokollen vedtaget her har potentiale til at besvare vigtige mekanistiske og translationelle spørgsmål vedrørende den rolle, astrocytter i udviklingen mandlige og kvindelige hjerner. Hele dyrkning procedure i modsætning til de fleste eksisterende teknikker genererer modne og sammenflydende kønsbestemt hippocampus astrocytter i to uger, om en hurtig vending af øvelser og enkelheden af teknikken vil lette anvendelsen af astrocytisk dyrkning metoden som et redskab til at studere køn specifikke rolle gliaceller i at udvikle hjernen hvorved den brede formidling i hjerneforskningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen af forfatterne har konkurrerende eller modstridende interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | Final Concentration: 1% |
| L-Leucine methyl ester hydrochloride | Aldrich | L1002-25G | Final Concentration: 5 mM |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| Trypsin | cellgro | 25-050-CI | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm round coverslips | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | Cell-culture grade |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | Cell-culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 70 μm Sterile cell strainer | Fisher scientific | 22363548 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 mL Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 mL Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1RSi | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | 5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | Rabbit monoclonal |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | Mouse monoclonal |
| Anti-HIF1alpha | abcam | ab179483 | Rabbit monoclonal |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Rabbit polyclonal |
| Anti-GFAP (cocktail) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Labs | PK-6101 | Contains 4 Reagents |
| Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 |
References
- Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
- Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
- Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
- Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V.
- Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
- Ferriero, D. M.
- Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
- Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
- Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
- Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
- McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
- Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
- Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
- Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
- Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women's health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
- Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
- Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294 (2014).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
- McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
- Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
- Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
- Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
- Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282 (2013).
- Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).
