Le séquençage de l'usine mur hétéroxylanes Utilisation enzymatique, chimique (méthylation) et physiques (spectrométrie de masse, résonance magnétique nucléaire) Techniques
Summary
This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).
Abstract
Ce protocole décrit les techniques particulières utilisées pour la caractérisation de l'extrémité réductrice (RE) et la séquence de glycosyle région interne (s) du hétéroxylanes. Les parois cellulaires endosperme de blé de-amidonnés ont été isolés comme un résidu insoluble dans l' alcool (AIR) 1 et séquentiellement l' extrait avec de l' eau (W-sol Fr) et de KOH 1 M contenant 1% de NaBH4 (KOH-sol Fr) tel que décrit par Ratnayake et al. , (2014) 2. Deux approches différentes (voir le résumé dans la figure 1) sont adoptées. Dans la première, W AX-sol intactes sont traitées avec 2AB pour marquer le résidu initial de sucre dans la chaîne du squelette RE et ensuite traités avec une endoxylanase pour produire un mélange de 2AB marqué RE et la région interne oligosaccharides réducteurs, respectivement. Dans une deuxième approche, le Fr KOH-sol est hydrolyse avec endoxylanase d'abord générer un mélange d'oligosaccharides qui sont ensuite marquées avec 2AB. Les ((dé) marqués) oligosaccharides libérés par voie enzymatique à la foisW- et Frs KOH-sol sont ensuite méthylé et l'analyse structurale détaillée des deux oligosaccharides natifs et méthylés est réalisée en utilisant une combinaison de MALDI-TOF-MS, une RP-HPLC-ESI-QTOF-MS et ESI-MS n. Endoxylanase digéré KOH-sol AX sont également caractérisés par résonance magnétique nucléaire (RMN), qui fournit également des informations sur la configuration anomérique. Ces techniques peuvent être appliquées à d'autres classes de polysaccharides à l'aide des endo-hydrolases appropriées.
Introduction
Hétéroxylanes sont une famille de polysaccharides qui sont des polysaccharides non cellulosiques prédominantes des parois primaires des graminées et les parois secondaires de tous les angiospermes 3-6. Les backbones xylane diffèrent dans leurs types et les modèles de substitution avec glycosyl (acide glucuronique (GlcA), arabinose (Araf)) et non-glycosyl (O-acétyle, l' acide férulique) des résidus en fonction de type de tissu, le stade de développement et les espèces 7.
Les murs du blé (Triticum aestivum L.) endosperme se composent principalement de arabinoxylanes (AXS) (70%) et (1 → 3) (1 → 4) -β-D-glucanes (20%) avec des quantités mineures de cellulose et heteromannans (2% chacun) 8. Le squelette de xylane peut être diversement non substitué et essentiellement mono-substitué (principalement O-2 positions et, dans une moindre mesure, O-3 positions) et disubstitués (O 2 et O 3 positions) avec des α-L-Ara résidus f 9. L'extrémité réductrice (RE) des hétéroxylanes de dicotylédones (par exemple, Arabidopsis thaliana) 10 et gymnospermes (par exemple, Epicéa (Picea abies)) 11 contient une séquence tétrasaccharide glycosyle caractéristique; -β-D-Xyl p – (1 → 3) -α-L-Rha p – (1 → 2) -α-D-Gal p A (1 → 4) -D-Xyl p. Pour comprendre la biosynthèse et de la fonction (biologique et industriel) hétéroxylane, il est important pour séquencer complètement le squelette de xylane pour comprendre les types et les modèles de substitution, ainsi que la séquence de l'extrémité réductrice (RE).
Des techniques spécifiques utilisées pour la caractérisation structurale de l'extrémité réductrice (RE) et la séquence de glycosyle région interne (s) de hétéroxylanes sont décrits dans ce manuscrit. Les techniques reposent sur fluorophore de marquage (avec 2 aminobenzamide (2AB)) de l'extrémité réductrice (RE) de la chaîne hétéroxylane avant l'enzymatique (endoxylanase) hydrolyse. Cette approche, en particulier pour le séquençage de RE, étaitd' abord rapporté par le laboratoire York 10,12-13 , mais est maintenant étendu pour inclure la région de séquençage interne et est une combinaison de techniques établies qui est également adaptable à tous les hétéroxylanes indépendamment de leur source d'isolement. Cette approche peut également être appliquée à d'autres classes de polysaccharides en utilisant (le cas échéant) les endo-hydrolases appropriées.
Dans la présente étude, endosperme de blé parois de-amidonné cellulaires ont été isolés comme un résidu insoluble dans l' alcool (AIR) et séquentiellement extrait avec de l' eau (W-sol Fr) et KOH 1 M contenant 1% de NaBH4 (KOH-sol Fr) comme décrit dans Ratnayake et al. (2014) 2. Les oligosaccharides libérés à la fois W- et Frs KOH-sol sont alors méthylé et l'analyse structurale détaillée des deux oligosaccharides natifs et méthylés est réalisée en utilisant une combinaison de MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS-couplé à HPLC avec le une séparation chromatographique en ligne en utilisant une RP colonne C-18et ESI-MS n. Endoxylanase digéré KOH-sol AX a également été caractérisée par résonance magnétique nucléaire (RMN).
Protocol
Representative Results
Discussion
La plupart des ossatures paroi cellulaire des polysaccharides de la phase de matrice ont apparemment au hasard substitué (à la fois glycosyle et des résidus non glycosylés) , qui sont très variables en fonction de l'espèce végétale, le stade de développement et le type de tissu 3. Comme polysaccharides sont des produits de gènes secondaires leur séquence est pas modèle dérivé et il n'y a donc pas d'approche analytique unique, comme il en existe pour les acides nucléiques et les prot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by funds from Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, provided to the High Fibre Grains Cluster via the Food Futures Flagship. AB also acknowledges the support of an Australia Research Council (ARC) grant to the ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls (CE110001007).
Materials
| 2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
| sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Model – MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
| Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
References
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