Visualização dos Vascular e parênquima regeneração após 70% hepatectomia parcial em ratos normais
Summary
Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.
Abstract
Um procedimento de injecção de silicone modificado foi usado para a visualização da árvore vascular hepática. Este procedimento consistiu na injecção in vivo do composto de silicone, através de um cateter de 26 G, para o portal ou na veia hepática. Após a injeção de silicone, órgãos foram explantados e preparado para micro-CT (μCT) digitalização ex-vivo. O procedimento de injeção de silicone é tecnicamente desafiador. Alcançar um resultado bem-sucedido requer uma vasta experiência microcirúrgica do cirurgião. Um dos desafios deste procedimento envolve a determinação da taxa de perfusão adequada para o composto de silicone. A taxa de perfusão para o composto de silicone tem de ser definido com base na hemodinâmica do sistema vascular de interesse. taxa de perfusão inadequada pode levar a uma perfusão incompleta, dilatação artificial e ruptura de árvores vasculares.
A reconstrução 3D do sistema vascular foi baseado em tomografias e foi realizada comsoftware pré-clínico, tais como HepaVision. A qualidade da árvore vascular reconstruído foi directamente relacionada com a qualidade da perfusão de silicone. Subsequentemente vasculares parâmetros computados indicativos de crescimento vascular, tais como o volume vascular total, foram calculadas com base nas reconstruções vasculares. Contrastando a árvore vascular com silicone permitido para processamento subsequente histológica do espécime após a digitalização μCT. A amostra pode ser submetida a cortes seriados, análise histológica e diapositivos de todo, e, posteriormente, para a reconstrução 3D das árvores vasculares com base em imagens histológicas. Este é o pré-requisito para a detecção de eventos moleculares e sua distribuição em relação à árvore vascular. Este procedimento de injecção de silicone modificado também pode ser usado para visualizar e reconstruir os sistemas vasculares de outros órgãos. Esta técnica tem o potencial de ser aplicados extensivamente para estudos relativos à anatomia vascular e crescimento em vários animais umamodelos de doenças nd.
Introduction
A regeneração hepática é muitas vezes determinada pela medição do aumento de peso do fígado e do volume e através da avaliação da taxa de proliferação dos hepatócitos 16. No entanto, a regeneração hepática não só é induzir a regeneração do parênquima, mas também a regeneração vascular 6. Portanto, o crescimento vascular devem ser investigados no que diz respeito ao seu papel na progressão da regeneração hepática. A visualização do sistema vascular hepática é crítica para avançar a nossa compreensão da regeneração vascular. Numerosos métodos indirectos foram desenvolvidas para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à regeneração vascular hepática. Tradicionalmente, a detecção de citocinas (factor de crescimento endotelial vascular, VEGF) 14, quimiocinas e seus receptores (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 ter sido o esteio para estudar a regeneração vascular. No entanto, um modelo 3D em conjunto com a análise quantitativa da vasculatura acrescentaria anatómica críticainformações para obter uma melhor compreensão da relação importante entre o parênquima hepático e regeneração vascular.
Para visualizar o sistema vascular hepática, o que requer contrastando as árvores vasculares, os ratinhos foram injectados com um agente de contraste radiopaco borracha de silicone directamente para o portal ou árvore vascular venoso hepático. Após a polimerização do silicone e explante do órgão, as amostras de fígado foram submetidos a varrimento μCT usando um aparelho de tomografia computadorizada. Os exames resultaram em representações imagem voxel do silicone de injecção 9 espécimes.
Para o controlo de qualidade, o sistema vascular foi visualizado pela primeira vez em 3D utilizando o software pré-clínico. Segmentação foi realizada através da criação de um limite entre a intensidade de tecidos moles e a intensidade navio. A máscara navio resultante foi visualizada usando renderização superfície. O software também permitiu a determinação manual dos dois parâmetros de Vasculcrescimento ar: comprimento do navio máxima e raio.
Um software pré-clínico foi então usado para a reconstrução 3D de árvores vasculares e subsequente cálculo dos territórios vasculares fornecimento ou drenagem 13. Além disso, este software determinado automaticamente certos parâmetros de crescimento vascular, tais como o comprimento total de todas as estruturas vasculares visíveis também conhecido como o comprimento da aresta ou volume total total do vaso.
O procedimento de silicone perfusão foi realizada em camundongos normais e em ratos que foram submetidos a 70% hepatectomia parcial (HP). Os fígados foram recolhidos a diferentes pontos de tempo de observação após a ressecção para analisar vascular e do parênquima regeneração do fígado utilizando a técnica de visualização e quantificação acima mencionado.
Os objetivos principais deste filme são: (1) demonstrar a injeção delicada técnica necessária para atingir contraste ideal e (2) mostram o potencial fr benefício resultanteom uma análise detalhada da amostra resultantes usando μCT e cortes seriados histológicas. Depois de assistir a este filme, o leitor deve ter uma melhor compreensão de como injetar composto de silicone em um sistema vascular específico e da utilidade e aplicabilidade da técnica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Contrastando a árvore vascular por injecção de silicone e digitalização μCT foi introduzido em modelos de tumor e modelos de doenças neurológicas frequentemente para estudar a progressão 5,7,8,10 angiogénico. Melhorias na metodologia de injecção de silicone foram feitas no presente estudo para visualizar e quantificar o crescimento vascular após hepatectomia parcial em ratos.
Há uma série de passos críticos que necessitam de atenção para conseguir uma boa qualida…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding by the German Ministry of Education and Research (BMBF) via the systems biology network “Virtual Liver”, grant numbers 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS).The authors also thank Frank Schubert for technical support.
Materials
| PERFUSOR® VI | B.BRAUN | 87 222/0 | |
| Pipetus®-akku | Hirschmann | 9907200 | |
| Pipets | Greiner | 606180 | |
| micro scissors | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | Fine Science Tools (F·S·L) | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00649-11 | |
| needle-holder | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 12061-01 | |
| 1ml syringe | B.Braun | 9161406V | |
| 5ml syringe | B.Braun | 4606051V | |
| extension and connection lines | B.Braun | 4256000 | 30cm, inner ø1.2mm |
| 6-0 silk (Perma-Hand Seide) | Ethicon | 639H | |
| 6-0 prolene | Ethicon | 8711H | |
| Microfil® MV diluent | FLOW TECH, INC | ||
| Microfil® MV – 120 | FLOW TECH, INC | MV – 120 (blue) | |
| MV curing agent | FLOW TECH, INC | ||
| Heparin 2500 I.E./5ml | Rotexmedica | ETI3L318-15 | |
| Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | E15117/D DE | |
| Imalytics Preclinical software | Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany | ||
| HepaVision | Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany | ||
| NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner | Hamamatsu Electronic Press, Japan | C9600 | |
| Tomoscope Duo CT | CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany | TomoScope® Synergy | |
References
- Bearden, S. E., Segal, S. S. Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles. Microcirculation. 12 (2), 161-167 (2005).
- Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models. Toxicol.Ind.Health. 13 (4), 407-484 (1997).
- Dai, D., et al. Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice. Neurosurgery. , (2015).
- Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468 (7321), 310-315 (2010).
- Downey, C. M., et al. Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors. PLoS.One. 7 (7), 41685 (2012).
- Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. , (2014).
- Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. Am.J.Pathol. 184 (2), 431-441 (2014).
- Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).
- Gremse, F., et al. Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis. J.Vis.Exp. (100), (2015).
- Jing, X. L., et al. Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible. Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5 (4), 223-230 (2012).
- Melloul, E., et al. Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy. J.Surg.Res. 187 (2), 458-465 (2014).
- Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. Registration of histological whole slide images guided by vessel structures. J.Pathol.Inform. 4 ((Suppl)), 10 (2013).
- Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. Analysis of vasculature for liver surgical planning. IEEE Trans.Med.Imaging. 21 (11), 1344-1357 (2002).
- Shergill, U., et al. Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration. Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298 (5), 1279-1287 (2010).
- Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. J.Surg.Res. 184 (1), 365-373 (2013).
- Wei, W., et al. Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration. Eur.Surg.Res. 54 (3-4), 97-113 (2015).
- Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J.Vis.Exp. (92), e51955 (2014).
