分离与鉴定具有干细胞特性的头颈部鳞状细胞癌亚群

摘要

在过去的十年中，了解癌干细胞样细胞在肿瘤复发和治疗耐药性中的作用已成为备受关注的研究课题。本文描述了从头颈部鳞状细胞癌细胞系（HNSCC）中分离和鉴定癌干细胞样细胞亚群的方法。

摘要

尽管对头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）进展的理解已取得进展，但由于局部复发和远处转移，其五年生存率仍然较低。为解释这种复发现象，一种假说认为是由于存在具有内在化疗和放疗抵抗性的癌干细胞样细胞（CSCs）。为了开发新的治疗策略，有必要建立能够验证靶向治疗有效性的实验模型，因此需要可靠的方法来识别和分离CSCs。为此，我们提出了一种从人HNSCC细胞系中分离CSCs的实验方案，该方案依赖于通过荧光激活细胞分选（FACS）进行的两次连续细胞分选组合。第一次分选基于CSCs高表达ATP结合盒（ABC）转运蛋白的特性，从而能够主动排出包括Hoechst 33342在内的活体DNA染料。通过该方法分选出的细胞被鉴定为一种 "侧群细胞" （SP）。由于SP细胞所占比例较低（<5%）的亲代细胞时，在进行第二次细胞分选前需进行增殖培养以扩增细胞数量。下一步可筛选出具有另外两种头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）干细胞特征的细胞 即 细胞表面标志物 CD44 的高表达水平（CD44^高) 以及醛脱氢酶（ALDH）的过表达^高）。由于单一标志物在分离肿瘤干细胞（CSCs）方面存在诸多局限性和缺陷，联合使用SP、CD44和ALDH标志物将为分离具有活力的CSCs提供一种有效工具，以用于后续的分析和功能实验。CSCs的干细胞样特性最终得到验证 体外 通过肿瘤球的形成和β-catenin的表达。

引言

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是全球常见的恶性肿瘤，尽管现有治疗手段已取得进展，但晚期患者的预后仍然较差。尽管采用了包括手术、化疗放疗和靶向治疗在内的综合治疗方案，患者的总体5年生存率仍仅为约30%。近期研究表明，局部复发和远处转移可能与抗癌治疗后癌干细胞样细胞（CSCs）的存活有关¹。越来越多的证据支持在多种实体瘤（包括乳腺、脑、前列腺、肺、结肠、胰腺、肝脏和皮肤肿瘤）中存在具有干细胞特性的细胞（未分化状态、自我更新和分化能力以及端粒酶活性）^2-10。然而，CSCs的起源仍不明确^11,12。它们可能来源于正常干细胞的恶性转化^3,13，或由获得CSC样特征的肿瘤细胞去分化而来^14,15。因此，深入了解与CSCs相关的特异性通路，将有助于对耐药性HNSCC的早期诊断和治疗。

有研究提出，肿瘤干细胞（CSCs）还具有耐药表型，能够逃避常规化疗和放疗，与大多数肿瘤细胞相比更易导致肿瘤复发^16-19，并且主要定位于缺氧微环境²⁰。目前已有多种因素被用来解释CSCs的这种耐药性，例如倾向于静息状态、增强的DNA修复能力、上调的细胞周期调控机制以及自由基清除能力²¹。此外，一些致癌分子通路可能在CSCs中被特异性激活¹⁷。为了深入理解CSCs并开发更有效的靶向治疗策略，迫切需要建立可靠的方法来识别和分离CSCs，这主要是由于不同类型的癌症中干细胞相关标志物存在高度异质性²²。

在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中，已通过分选表达不同肿瘤干细胞（CSC）生物标志物（如药物外排转运蛋白表达²³、CD44^high、CD24^low CD133^high、c-Met⁺表型^10,24,25或ALDH^high活性²⁶）的细胞，从原发性患者肿瘤中分离出具有干细胞样特性的肿瘤起始细胞；也可通过培养原发性患者肿瘤形成具有CSC特性的鳞状细胞球（squamospheres）。然而，经过两次传代后，鳞状细胞球的数量显著减少，导致可用于进一步表征研究的样本量较小²⁷。因此，从已建立的稳定细胞系出发开展体外（in vitro）实验，是更简便的研究方案，有助于深入理解肿瘤干细胞的特性。

本文旨在提出一种利用多参数流式细胞术分析和细胞分选技术从头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系中分离肿瘤干细胞（CSCs）的方法。通过检测CD44的表达，并结合多种CSC特性，包括ALDH活性、侧群（Side Population, SP）表型、成球能力及致瘤性，用于分离和鉴定这一CSC亚群。CD44是一种细胞表面糖蛋白，参与细胞黏附和迁移过程，在多种实体瘤的肿瘤干细胞中高表达。²⁸，包括头颈部癌症模型^29-31此外，CD44^高 细胞可以产生 体内 异质性肿瘤，而CD44^低 细胞无法¹⁰SP检测法基于细胞外排Hoechst染料能力的差异²² 通过在肿瘤干细胞（CSC）膜上过表达的ATP结合盒（ABC）转运蛋白家族介导。该检测包括在对照样本中使用ABC转运蛋白抑制剂，如维拉帕米。醛脱氢酶（ALDH）是一种细胞内酶，参与早期干细胞分化过程中视黄醇向视黄酸的转化。^25,26表现出高ALDH活性的细胞在HNSCC中呈现类干细胞行为²⁶ 且仅有极少数的ALDH^高 细胞能够形成肿瘤 体内^26,32.

这些标记物和特性的组合已被Bertrand等人成功应用等。 研究耐药性 体外 和 体内 这些CSCs对光子和碳离子辐射的反应¹⁹他们的结果清楚地表明，与单一标记物方法相比，多种细胞标记物和特性的组合在对头颈部鳞状细胞癌干细胞群体进行有效研究时具有更高的选择性。

方案

所有动物实验均按照当地动物护理指南进行。本研究的所有细节均获得了法国伦理委员会CECCAPP的批准。

1. 通过Hoechst染料外排法筛选侧群细胞（SP）

1. 使用 Hoechst 33342 染料对 5000 万个细胞进行染色。
   1. 准备两个带有锥形底部的无菌 15 ml 离心管：一个标记为 "Hoechst"，另一个标记为 "Hoechst and Verapamil"。用无菌水配制 10 ml 的 5 mM 盐酸维拉帕米（Verapamil hydrochloride）溶液。准备干细胞培养基（CM）。
      1. 为制备 CSC 培养基（CM-CSC），按以下组分混合：Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）:F12（1:3, v:v）、5% 胎牛血清（FCS）、0.04 mg/L 氢化可的松（hydrocortisone）、100 U/ml 青霉素、0.1 g/L 链霉素和 20 µg/L 表皮生长因子（EGFR）。
   2. 在超净工作台内，用胰蛋白酶消化细胞。吸除培养基，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，并为 75 cm² 培养瓶加入 1 ml 胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.5 g/L）。在 37 °C 下孵育 3 分钟。加入亲本细胞系所用的培养基以终止反应。使用细胞计数器计数细胞数量。
      1. 为制备亲本细胞系培养基（CM-P），在 DMEM 中添加 10% FCS、0.4 mg/L 氢化可的松、100 U/ml 青霉素和 0.1 g/L 链霉素。
   3. 将步骤 1.1.2 获得的细胞悬液稀释至 10⁷ 个细胞/ml（使用 CM-P 培养基）。将细胞悬液分装至上述两个离心管中：取 100 µl（含 10⁶ 个细胞）加入 "Hoechst and Verapamil" 管，取 4 ml（含 4 × 10⁷ 个细胞）加入 "Hoechst" 管。
   4. 在 "Hoechst and Verapamil" 样品中加入 10 µl 的 5 mM 盐酸维拉帕米溶液（终浓度为 0.5 mM），轻轻混匀。再加入 5 µl 的 1 g/L Hoechst 溶液（终浓度为 0.1 g/L）。在 "Hoechst" 样品中，按每 10⁶ 个细胞加入 5 µl 的 1 g/L Hoechst 溶液（共 200 µl）。此后，使用铝箔包裹样品以避免直接光照。
   5. 将所有离心管置于 37 °C 水浴中孵育 1 小时 30 分钟。每隔 15 分钟轻轻混匀一次，防止细胞沉淀。
   6. 在 4 °C 下以 250 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，将每个沉淀用 2 ml 的 1× PBS 重悬。
   7. 在 4 °C 下以 250 × g 离心 5 分钟。吸除上清液。将 "Hoechst and Verapamil" 管中的沉淀用 500 µl 含 5 mg/L 碘化丙啶（PI）的 PBS 缓冲液重悬，将 "Hoechst" 管中的沉淀用 4 ml 含 5 mg/L PI 的 PBS 缓冲液重悬。
   8. 将样品溶液经 70 µm 细胞滤网过滤，以去除聚集体，并将单细胞收集至流式细胞仪上样用的离心管中。样品需置于冰上，并用铝箔避光保存。
2. 通过细胞分选分离排除 Hoechst 染料的侧群细胞。
   1. 使用以下参数在流式细胞分选仪上进行 Hoechst 阴性细胞的分离：紫外激光（355 nm）、在紫外激光通路上设置两个检测器，分别配备蓝色 Hoechst（450/50 BP）和红色 Hoechst（610/20 BP）滤光片，以及两个收集器。
      1. 首先分析作为染色和流式细胞仪设置阳性对照的 "Hoechst" 样品。
      2. 在细胞仪软件的 "Global Worksheet" 窗口中，点击 "Dot Plot"（右上角第五个图标），在全局工作表中创建图表。纵坐标通过右键选择 FSC-A（前向散射），横坐标选择 SSC-A（侧向散射）（图 1A）。同样方法创建 SSC-W 与 SSC-H 的散点图。在该第二张散点图上，点击 "Polygon gate"（右上角第十四张图标）创建 P1 区域（图 1B）³³。
         注：P1 区域将包含单细胞并排除双细胞团。
      3. 可选：通过在 P1 上创建 FSC-A 与 PI 的散点图排除 PI 阳性细胞。在该散点图中选择 PI 阴性群体（P2），以排除 PI 阳性的死亡细胞。
      4. 在细胞仪软件的 "Global Worksheet" 窗口中，点击 "Dot Plot"，在全局工作表中创建图表。纵坐标通过右键选择蓝色 Hoechst-A，横坐标选择红色 Hoechst-A。右键点击细胞群，选择 "Show population" 和 P1。在该散点图上创建一个区域（P2），以选择位于主细胞群左侧的 Hoechst 染料阴性侧群（SP）细胞（图 1C）。
   2. 分析 "Hoechst" 样品并收集 10,000 个事件。为确保代表 SP 群体的门控 P2 位置准确，进一步分析 "Hoechst and Verapamil" 样品（10,000 个事件），以观察 SP 群体的消失（图 1D）。
   3. 将 SP 的 Hoechst 染料阴性细胞收集至一个含有 1 ml 步骤 1.1.1.1 中制备的 CM-CSC 的 15 ml 离心管中。
   4. 细胞分选结束后，在 250 × g 下离心细胞悬液 5 分钟，吸除上清液，并用 1 ml CM-CSC 重悬沉淀。使用细胞计数器计数分选后的细胞数量，并将适量细胞转移至培养瓶中（见 表 1）。加入 CM-CSC，于 37 °C 及 5% CO₂ 环境中孵育。
   5. 在相同培养条件下维持细胞培养，最多传代 2 次，直至获得至少 5 × 10⁷ 个细胞（见步骤 3，“细胞培养方法”"Cell culture method"）。

2. 侧群分选后CD44^high/ALDH^high亚群的筛选

1. 使用ALDH检测试剂盒和CD44抗体对5000万个SP细胞进行染色。
   1. 准备七个15 ml无菌管，分别标记为："未染色"（a管）、"CD44-APC"（b管）、"IgG1-APC"（c管）、"ALDH"（d管）、"ALDH和DEAB"（e管）、"ALDH和CD44-APC"（f管）、"ALDH、DEAB和CD44-APC"（g管）。染色过程中所有试管和试剂均需保持在4 °C。
   2. 用4.5 ml缓冲液1（试剂盒内含）和45 µl CD44-APC（别藻蓝蛋白）抗体（稀释比例1:100）配制缓冲液A。用100 µl缓冲液1和1 µl IgG1-APC抗体（稀释比例1:100）配制缓冲液B。用4 ml缓冲液1和20 µl试剂盒中的试剂配制缓冲液C。
   3. 将先前分选的细胞（步骤1.2.5）制备成浓度为10⁷个细胞/ml的单细胞悬液。取100 µL（10⁶个细胞）细胞悬液加入a、b、c管中，取4 ml（4 × 10⁷个细胞）加入f管。暂时不在d、e、g管中加入细胞。
   4. 将含有细胞的试管在250 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，将a、b、c管中的沉淀用100 µl缓冲液1重悬。向e管和g管中各加入5 µl二乙氨基苯甲醛（DEAB，ALDH抑制剂）。
      1. 将f管中的细胞用4 ml试剂C重悬，立即取100 µl转移至d、e、g管中。将所有试管置于37 °C水浴中孵育30分钟，并用铝箔避光。孵育15分钟后轻轻涡旋混匀，防止细胞沉降。
   5. 此后所有操作均需将试管置于冰上，并用铝箔避光。将所有试管在4 °C、250 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。
   6. 将f管用4 ml缓冲液A重悬，b管和g管用100 µl缓冲液A重悬，c管用100 µl缓冲液B重悬。其余各管加入100 µl缓冲液1。4 °C孵育10分钟。
   7. 将所有试管在4 °C、250 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。用1 ml缓冲液1（f管用4 ml）洗涤一次，再次在4 °C、250 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。将f管沉淀用4 ml缓冲液1重悬，其余各管沉淀用1 ml缓冲液1重悬。
   8. 将样品溶液通过70 µm细胞筛网过滤，去除细胞团块，收集单细胞至合适的试管中，用于流式细胞仪上样。
2. 通过荧光激活细胞分选法分离CD44^high/ALDH^high细胞群体。
   1. 在流式细胞分选仪上进行CD44^high/ALDH^high细胞分选，设置如下参数：蓝色激光（488 nm）和红色激光（633 nm），蓝色激光路径配备一个带FITC滤光片（530/30）的检测器，红色激光路径配备一个带APC滤光片（660/20）的检测器，以及两个收集器。
   2. 在细胞仪软件中，点击"点图"（右上角第五个图标），创建FSC-A与SSC-A的点图（如第1.2.1.2节所述），用于检查细胞形态，并通过SSC-W与SSC-H点图选择单细胞群体。
   3. 在细胞仪软件的"全局工作表"窗口中，点击"点图"，在全局工作表中创建图表。纵坐标右键选择APC-A，横坐标选择FITC-A，以选择双染细胞群体。利用d管和e管创建门控，选择ALDH^high细胞（图2A）。注意：经DEAB处理的e管中阳性细胞消失（图2B）。
      1. 在同一图表中，利用b管和c管创建第二个门控，以选择CD44^high细胞（图2C和图2D）。含IgG1-APC的试管中阳性细胞应消失。分析f管和g管，创建第三个门控，包含CD44^high/ALDH^high细胞（图2E和图2F）。
         注意：若含IgG1-APC的试管中出现阳性细胞（图2D），则表明细胞与APC标记抗体之间的结合非特异性。
   4. 将CD44^high/ALDH^high细胞收集至含有1 ml CM-CSC的15 ml试管中。同时将CD44^low/ALDH^low细胞收集至含有1 ml CM¹⁹的15 ml试管中。注意：CM-CSC的配制方法见步骤1.1.1.1。
   5. 将细胞悬液在250 × g条件下离心5分钟，弃去上清液，沉淀用1 ml CM-CSC重悬。计数分选后的细胞数量。

3. 细胞培养方法

1. 在如上所述对细胞进行双重分选后，将分选后的细胞接种至合适的培养瓶中（表1) 在37 °C、5 % CO₂条件下与CM-CSC共培养₂18–24 小时后，检查细胞是否已贴壁，并更换培养基。每 3 天更换一次培养基，直至扩增的细胞集落融合度超过 50%。
2. 使用适当体积的0.5 g/L胰蛋白酶-EDTA溶液表1) 消化培养瓶中的细胞。在 37 °C 下孵育 3 至 5 分钟。加入适量体积的 CM-CSC（表1以终止胰蛋白酶的作用。
3. 统计获得的细胞数量，接种 4 x 10⁵ 175 cm² 培养瓶中的细胞用 CM-CSC 培养，于 37 °C、5 % CO₂ 条件下孵育₂在此浓度下，倍增时间为24小时的细胞在7天后将达到70%融合度。
4. 使用CSCs进行 体外 或 体内 在经历3次传代之前进行实验。

4. 肿瘤潜能和肿瘤干细胞特性的确认

1. 肿瘤球形成实验以验证CD44的肿瘤潜能^高/ALDH^高 细胞
   1. 按照3.2节所述方法进行细胞消化。加入1 x 10⁶ 将细胞转移至15 ml离心管中，以250 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 DMEM:F12（3:1）培养基，无FCS，添加20 ng/ml rhEGF、4 mg/L 肝素和1× B27。将细胞接种于6孔低黏附培养板中，在37 °C、5% CO₂条件下培养₂.
      注意：若细胞在无FCS条件下无法生长，应使用含5% FCS、20 ng/ml rhEGF、4 mg/L 肝素和1x B27的DMEM:F12（3:1）培养基。
   2. 在接种后第4至10天，使用光学显微镜观察肿瘤球的形成情况（图3A).
      注意：肿瘤球直径应大于 35 µm。CD44^高/ALDH^高 与CD44相比，细胞在肿瘤球形成方面将表现出更快的速度以及数量和尺寸上的显著增强^低/ALDH^低.
2. 评估 在体 内 皮下注射CD44后的肿瘤发生性^高/ALDH^高 NOD-SCID 小鼠中的细胞
   1. 分选后，将细胞重悬于 PBS 中，配制成三种不同浓度（10⁴ 细胞/毫升，10⁵ 细胞/毫升，和10⁶ 细胞/ml）。皮下注射 100 µl 的 10⁴ 细胞/毫升（10³ 在6只小鼠的右侧 flank 区域接种细胞。对另外10只小鼠进行相同操作。⁵ 细胞/毫升（10⁴ 细胞）和10⁶ 细胞/毫升（10⁵ 细胞）
      注意：稀释倍数低于 10³ 细胞可以进行检测。
   2. 注射相同浓度的CD44^低/ALDH^低 左 flank 区域的细胞。对注射后的小鼠监测长达 10 周，以观察肿瘤进展¹⁹.

结果

由于亲本细胞系中肿瘤干细胞（CSCs）比例极低，从头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系中分离CSCs需要进行两次连续分选。第一次分选基于CSCs可通过药物外排转运蛋白排除Hoechst染料的特性，由此可获得占总细胞群1-5%的细胞（图1）。在Hoechst染料阴性细胞分选过程中，通过观察FSC-A与SSC-A点图来检查分选细胞的大小和颗粒度（图1A）。然后，利用SSC-W与SSC-H点图区分双联体和细胞碎片，并选中P1细胞群（图1B）。在该P1细胞群基础上，构建Hoechst Red-A与Hoechst Blue-A点图。使用标记为“Hoechst”的试管时，侧群（SP）表现为位于主细胞群左侧的一个侧臂（图1C）。当细胞经维拉帕米（Verapamil）处理后，该细胞群应消失（图1D），维拉帕米是ABC转运蛋白的抑制剂。碘化丙啶（PI）染色可用于排除PI阳性的死亡细胞，因为该细胞群在Hoechst Red-...

讨论

本方案描述了一种从特定细胞系中成功分离肿瘤干细胞（CSCs）的可靠方法，该方法可适用于其他头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系。分离得到的头颈部肿瘤干细胞适用于进一步的分子表征研究 体外 通过在免疫缺陷小鼠中移植进行功能验证¹⁹然而，可根据侧群细胞或CD44的不同，尝试一些相应的改进方法。^高/ALDH^高 亲本细胞系中存在的百分比。例如，如果某特定细胞系中侧群细胞的比例过低，则CD44^高/ALDH^高 可直接进行分选。本研究中使用的标记物可根据所研究的细胞系替换为其他合适的标记物，例如 CD133^{高 34} 或 CD10^{高 35}.

本方案基于两次细胞分选。在所测试的细胞系中，无法实现SP+CD44+ALDH三色分选。首先，此处测试的亲本细胞系中SP细胞比例低于5%，CD44阳性细胞比例低于10%^高/ALDH^高 SP中的细胞。因此，SP/CD44^高/ALD...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
优质胎牛血清	GE Healthcare	A15-151
水溶性氢化可的松	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
青霉素/链霉素（100倍浓度）	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM 培养基	Gibco	61965-026
F12 营养混合物（1倍浓度）+ GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	该溶液必须在使用前新鲜配制，因其极不稳定
肝素	StemcellTM Technologies	7980
B-27 添加剂（50倍浓度），不含维生素A	Gibco	12587-010
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	腐蚀性，急性毒性（经口、经皮、吸入）类别4
盐酸维拉帕米	Sigma-Aldrich	V-4629	急性毒性（经口、经皮、吸入）类别3
碘化丙啶	Sigma-Aldrich	P4170	急性毒性（经口、经皮、吸入）类别4
ALDEFLUOR 试剂盒	Stem Cell	1700
CD44-APC 人源抗体	Miltenyi Biotech	130-095-177
IgG1-APC 人源抗体	Miltenyi Biotech	130-093-189
Z1 库尔特颗粒	Beckman Coulter	6605698
光学显微镜	Olympus	CKX31
SQ20B 细胞系	由 John Little’s 实验室惠赠	-
FaDu 细胞系	ATCC	HTB-43
低附着培养板	Thermo Fischer Scientific	145383
BD FACSDiva 软件 v8.0.1	BD Biosciences	-