Bir Baş-Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu subpopülasyonu olması Kök Hücre Özellikleri İzolasyonu ve Karakterizasyonu
Summary
Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).
Abstract
baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom (HNSCC) ilerleme anlayışı ilerlemelere rağmen, beş yıllık sağkalım oranı nedeniyle lokal nüks ve uzak metastaz düşük kalmaktadır. bu nüksetme açıklamak için bir hipotez içsel kemo ve radyo direnci mevcut kanser kök-benzeri hücreler (rulmanları) varlığıdır. Yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için, hedeflenen tedavi etkinliğini doğrulamak deney modelleri vardır ve bu nedenle CSCS tanımlanması ve izole edilmesi için güvenilir bir yöntem olması gereklidir. Bu amaçla, flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması tarafından gerçekleştirilen iki ardışık hücre sortings (FACS) birleştirilmesine dayanır, insan HNSCC hücre çizgilerinden CSCS izolasyonu için bir protokol mevcut. İlki, diğerleri arasında, dışlamak böylece Kaset (ABC) taşıyıcı proteinler ATP-bağlama ve aşın için CSCS özelliğine dayanmaktadır gibi Hoechst 33342. hücreleri gibi hayati DNA boyalar th ile sıralanıryöntem, bir "yan nüfus" (SP) olarak tanımlanır edilir. SP hücreleri düşük bir yüzde ebeveyn hücrelerinin (<% 5) 'i temsil olarak, giderek artan bir fazı ikinci hücre sıralama önce sayısını arttırmak için gereklidir. Bir sonraki adım, iki HNSCC kök hücre özellikleri hücresi yüzey markerine CD44 (yüksek CD44) ve aldehit dehidrojenaz aşırı ifadesi (ALDH yüksek) yüksek ekspresyon seviyesi, yani sahip hücrelerin seçilmesine izin verir. Tek bir belirteç kullanımı CSCS, SP kombinasyonu izolasyonu için çok sayıda sınırlamalar ve tuzaklar olduğundan, CD44 ve ALDH belirteçleri canlı hücreleri gerektiren başka analitik ve fonksiyonel testleri için CSCS izole etmek için yararlı bir araç sağlayacaktır. CSCS sap benzeri özellikleri son tumorispheres oluşumu ve β-katenin sentezlenmesi ile in vitro koşullarında doğrulanmıştır.
Introduction
Baş ve boyun yassı hücreli karsinom (HNSCC), tüm dünyada sık görülen ve mevcut tedavilerde kaydedilen ilerlemelere rağmen, ilerlemiş hastalığı olan hastaların prognozu kötüdür. Hastanın genel 5 yıllık sağ kalım oranı cerrahi, kemo-radyoterapi ve hedeflenen-terapiler dahil terapötik yaklaşımların kombinasyonu rağmen% 30 civarında olduğunu. Son çalışmalar antikanser tedaviler 1 Aşağıdaki kanser kök benzeri hücrelerin hayatta kalma (rulmanları) için lokal nüks ve uzak metastaz bağlıyor. Göğüs, beyin, prostat, akciğer, kolon, pankreas, karaciğer ve deri 2- dahil olmak üzere çeşitli katı tümörlerin kök hücrelerin özelliklerini (farklılaşmamış durum, kendini yenileme ve farklılaşma kapasitelerinin ve telomeraz aktivitesi) sunan hücrelerin varlığını destekleyen artan kanıtlar vardır 10. Ancak, CSCS kökeni 11,12 belirsizliğini koruyor. Normal kök hücreleri 3,13 veya dedifferen malign transformasyonu kaynaklanabilirCSCS benzeri özellikler 14,15 kazanmak tümör hücrelerinin sokan. Bu nedenle, CSCS ilişkin belirgin yollarının anlaşılmasında erken tanı ve dirençli HNSCC tedavisi konusunda bilgi verilecektir.
CSCS ayrıca tümör hücrelerinin 16-19 toplu karşılaştırıldığında tümör nüks sonuçlanan standart kemoterapi ve radyoterapi kaçmasına dirençli fenotipleri, sahip ve 20 nişler hipoksik içine lokalize olduğu öne sürülmüştür. Sayısız faktör gibi sessizliğini eğilimi olarak CSCS bu dirençleri, gelişmiş DNA onarım, up-regüle hücre döngüsü kontrol mekanizmaları ve serbest radikal süpürücü 21 açıklamak için öne sürülmüştür. Dahası, çeşitli onkojenik moleküler yollar özellikle CSCS 17 aktive edilebilir. daha hedefli tedaviler için CSCS bilgi geliştirmek için, kök hücre ile ilgili markörlerin heterojen bağlı, tanımlama ve CSCS izolasyonu için güvenilir yöntemler mikanser 22 çeşitli.
HNSCC olarak, kök benzeri tümör başlatan hücreleri, ilaç dışarı atım taşıyıcıları ifade 23, CD44 yüksek, CD24 düşük CD133 yüksek, c-Met + 10,24 fenotipe gibi farklı CSC biyobelirteçlerini (ifade hücreleri sıralayarak primer hasta tümörlerinden izole edilmiştir, 25 ya da ALDH yüksek aktiviteli 26) ya da CSC özelliklere sahip squamospheres oluşturmak için birincil hasta tümörü yetiştirilmesi. Bununla birlikte, squamospheres sayısı, böylece daha fazla karakterizasyon için küçük bir örneklem büyüklüğü 27 çalışmaları vererek, iki pasaj sonra dramatik azalır. Bu nedenle, in vitro deneyler, köklü hücre hatları başlayarak CSCS bilgisini geliştirmek için deney tasarımı için daha kolay bir çözümdür.
Bu makalenin amacı, multiparametrik akım sitometri analizi a kullanarak HNSCC hücre hatları CSCS izole etmek için bir yöntem önermektirnd hücre sıralama. ALDH aktivitesinin dahil olmak üzere birçok CSCS özellikleri ile ilişki içinde CD44 ekspresyonu, yan Nüfus (SP) fenotipi sferoid oluşturma yeteneğine ve tümör gelişimini izole edilmesi ve CSCS bu alt-nüfusu karakterize etmek için kullanılır. CD44, bir hücre yüzeyi glikoproteini, hücre yapışması ve göçü katılır. CD44 yüksek kafa ve boyun kanseri modelleri 29-31 de dahil olmak üzere, CSCS 28 bir çok katı tümörlerin olarak ifade edilir. Ayrıca, CD44 yüksek hücreler 10 olamaz in vivo CD44 düşük hücrelerin ise heterojen bir tümör oluşturabilir. SP deney CSC zarı içinde aşırı taşıyıcı proteinlerin ATP-bağlayıcı kaset (ABC) ailesi ile Hoechst boya 22 akıttığı hücre ayırıcı potansiyeli dayanır. Bu deney, bu kontrol numunelerinde verapamil ABC transportör inhibitörlerinin kullanılmasını içerir. Aldehit dehidrogenaz (ALDH) ret için retinol dönüştürme görev yapan hücre içi enzimerken kök hücre farklılaşması 25,26 sırasında inoic asit elde edildi. Yüksek ALDH aktivite göstermek HNSCC 26 kök benzeri hücre davranışını ve ALDH yüksek hücrelerin çok az sayıda sergileyen hücreler in vivo 26,32 tümör oluşturmak edebiliyoruz.
Bu belirteçlerin ve özellikleri kombinasyonu başarıyla Bertrand e t arkadaşları tarafından kullanılmıştır. Vitro ve foton bu CSCS in vivo ve karbon iyon radyasyonu 19 direncini incelemek için. Bu sonuçlar açık bir şekilde, çeşitli hücre belirteçleri ve özellikleri kombinasyonu tek markör yaklaşımlara göre HNSCC CSCS popülasyonları hakkında yararlı çalışmalar için daha seçici olduğu gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol için diğer HNSCC hücre çizgileri için geçerli olan özel bir hücre soyundan CSCS başarıyla izolasyonu için güvenilir bir yöntem tarif eder. İzole baş ve boyun CSCS bağışık yetmezliği olan farelere 19 transplantasyon in vitro ve fonksiyonel doğrulama ileri moleküler karakterizasyonu için daha sonra uygundur. Ancak, bazı değişiklikler yan nüfus veya ebeveyn hücre hattında bulunan CD44 yüksek / ALDH yüksek oranda bağlı test edile…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Thibault Andrieu and Sebastien Dussurgey from the Flow Cytometry Platform of UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) for their advice and help during our sorting. This work was achieved within the scientific framework of ETOILE and Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).
Materials
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
| CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
| IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
| FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
| Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
| BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | – |
References
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).
- Dalerba, P., et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Fang, D., et al. A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas. Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).
- Prince, M. E., et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells — Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Soltanian, S., Matin, M. M. Cancer stem cells and cancer therapy. Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Ratajczak, M. Z. Cancer stem cells — Normal stem cells ‘Jedi’ that went over to the ‘dark side.’. Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Liu, G., et al. Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma. Mol Cancer. 5, 67 (2006).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Bertrand, G., et al. Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation. Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).
- Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Chen, Z. G. The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer. J Oncol. 2009, 894064 (2009).
- Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes. Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).
- Zhang, Q., et al. A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy. Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).
- Sun, S., Wang, Z. Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis. Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).
- Chen, Y. C., et al. Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer. Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).
- Lim, Y. C., et al. Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas. Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).
- Yu, Q., Stamenkovic, I. Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).
- Krishnamurthy, S., et al. Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells. Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).
- Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).
- Chen, Y. W., et al. Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma–derived CD44(+)ALDH1(+) cells. Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).
- Clay, M. R., et al. Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase. Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).
- Meinelt, E., et al. . Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software. , (2012).
- Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line. Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).
- Fukusumi, T., et al. CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).
- Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer. Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).
- Kanojia, D., et al. Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice. Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
